论文部分内容阅读
鲤春病毒(Spring Viremia of Carp Virus,SVCV)是一种弹状病毒,主要发生于春季,它可以引起鲤科鱼类的鱼苗或成鱼大规模暴发鲤春病毒血症(SVC)。传染性胰脏坏死病毒(Infectious Pancreatic Necrosis Virus,IPNV)为双片段 RNA 病毒,引起传染性胰脏坏死病(IPN),该病属于世界性鱼病,主要危害虹鳟、大西洋鲑、大菱鉀大西洋鳕等十余种常见养殖鱼类的鱼苗。两种病毒均属于传染性病毒,疫情一旦发生,对渔业养殖造成严重危害。本研究中首先用海水鲤科鱼类细胞系(FHM)对经过纯化的SVCV和IPNV冻存样品进行增殖培养直至出现典型病变并收毒。通过设计的引物对两种病毒进行基因扩增,得到片段大小为714bp的SVCV、224bp的IPNV。然后连接到pMD18-T载体上构建重组质粒并进行测序,测序结果经NCBI在线nucleotide blast分析,再利用DNAStar构建核酸进化树,序列与SVCV糖蛋白核酸序列相似性高达99%,IPNV核苷酸同源率为79.9%-98.2%。将适量SVCV、IPNV细胞培养液喂养并注射进行人工感染。对出现典型病症的鲤鱼进行病毒检测,分别从定性、定量、定位三个方面建立分子生物学检测方法:RT-PCR、荧光定量RT-PCR和原位杂交法。RT-PCR法:根据合成的特异性引物,对人工感染的病鱼样品分别进行SVCV、IPNV检测,通过凝胶电泳得到一条714bp片段,表明人工感染SVCV成功,而病鱼中未检测到IPNV。荧光定量RT-PCR:根据SVCV、IPNV糖蛋白基因合成引物和探针,在试验中能够特异性检测SVCV和IPNV,对照组VHSV、IHNV、EHNV均没有扩增,结果说明所设计的引物均具有较好的特异性。将SVCV、IPNV标准品进行10倍系列稀释得到107～101的拷贝数,7个数量级浓度都有扩增,两种病毒的检测底限均小于101拷贝,表明灵敏性较高。每个稀释度进行4次重复,扩增曲线基本吻合,并相互平行,建立的方法重复性较好。SVCV标准曲线拷贝数(X)与CP(Y)值得关系为:CP=-3.331gX+32.00,扩增效率为1.882,Error为0.0297,IPNV标准曲线为CP=-3.211gX+30.68,其扩增效率为1.910,Error为0.0182。根据标准曲线,对病鱼检测结果进行计算,得到人工感染鲤鱼两个样品的SVCV相对浓度为104.14和103 29拷贝数,对感染IPNV的鲤鱼进行检测,没有扩增曲线,与RT-PCR检测结果一致。原位杂交法:根据糖蛋白基因设计特异性引物,对SVCV、IPNV进行扩增,纯化回收,并对回收产物进行DIG标记,得到DIG-SVCV、DIG-IPNV两种探针。通过比较对照标记反应产生点的强度差异,计算出地高辛标记DNA的量,在做Southern blot时,用杂交液稀释到25ng/mL使用,做组织切片杂交实验时稀释到1ng/μL使用。经过探针的特异性实验,结果表明,两种探针仅能够标记相应的病毒,对照组病毒不起交叉反应,具有良好的特异性。在人工感染实验中,SVCV感染的鲤鱼出现了典型的病变特征:体色深,腹部肿大,皮肤有明显出血现象,而IPNV感染没有病变现象。使用DIG-SVCV对人工感染的鲤鱼进行检测,结果在病鱼内脏、眼、脑、肌肉组织切片中均检测到了少量病毒。本实验建立的SVCV的原位杂交检测方法具有较高的特异性,易于操作,有助于SVCV的组织定位、发病机理的研究。