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本文主要从以下几方面进行论述： 第一部分 S14G-humanin对全脑缺血再灌注大鼠的神经保护作用及机制研究 目的: S14G-humanin(HNG)是Humanin(HN)的衍生物，可减少缺血再灌注损伤后心肌梗死体积。本研究的目的是观察全脑缺血再灌注大鼠海马神经元凋亡情况及HNG的干预作用，探讨HNG对缺血再灌注损伤的影响及作用机制，为HN及其衍生物用于缺血性脑损伤的治疗提供理论依据。 方法: 1.动物模型及干预 健康雄性SD大鼠分别为sham组、全脑缺血(global ischemia，GI)组和HNG治疗组，GI组和HNG组包括六个时间点(1、3、6、12、24、72 h)。采用改良的Pulsineli四血管闭塞法制作大鼠全脑缺血模型，断流10min后再灌注。HNG组给予HNG治疗，而GI组注射0.9％的生理盐水。 2.尼氏染色 脑石蜡切片脱蜡至水，将处理好的切片甲苯胺蓝染液染色，分化封片后，显微镜(NIKON ECLIPSE CI，Japan)镜检，图像采集分析，高倍镜下(10×40)对尼氏染色阳性神经元进行计数。 3.免疫组织化学染色 采用免疫组化染色试剂盒，检测海马CA1区p-信号转导与转录激活因子3(activates signal transducer and activator of transcription-3, STAT3)(Y705)、髓样细胞白血病基因-1（Myeloid cell leukemia1，MCL-1）、细胞因子信号抑制因子3(suppressor of cytokine signaling3，SOCS3)、Bax、Caspase3的表达，采用Motic Fluo1.0专业生物图像分析处理软件进行图片分析，计算光密度值。 结果: 1.HNG对尼氏小体的影响 全脑缺血再灌注导致SD大鼠海马CA1区神经元减少(P＜0.01)，HNG减轻缺血诱导的神经损伤(P＜0.05)。 2.HNG对Bax、Caspase-3、MCL-1、p-STAT3和SOCS3免疫组织化学染色的影响 免疫组织化学染色显示全脑缺血再灌注导致大鼠海马CA1区Bax、Caspase-3蛋白表达增加（P＜0.01），HNG治疗减少这两种蛋白的表达(P＜0.01)。全脑缺血再灌注减少MCL-1蛋白表达（P＜0.01），HNG治疗明显增加MCL-1表达(P＜0.01)。全脑缺血再灌注明显增加p-STAT3和SOCS3蛋白表达(P＜0.01)，HNG明显增加这两种蛋白的表达(P＜0.05）。 3.GI组P-STAT3和SOCS3表达上调，MCL-1表达下调 免疫印迹分析显示全脑缺血再灌注大鼠海马P-STAT3和SOCS3蛋白表达上调(P＜0.01)，荧光定量PCR显示全脑缺血再灌注大鼠海马STAT3和SOCS3mRNA的表达增加(P＜0.01)。全脑缺血再灌注大鼠海马MCL-1蛋白和mRNA表达下调（P＜0.01）。 4.HNG治疗干预后P-STAT3、MCL-1和SOCS3表达上调 免疫印迹分析显示HNG干预后p-STAT3、MCL-1和SOCS3蛋白表达增加(P＜0.01)，荧光定量PCR显示STAT3、MCL-1和SOCS3 mRNA表达也明显增加(P＜0.01)。 结论: 全脑缺血10min再灌注后SD大鼠海马出现神经细胞损伤，HNG治疗降低凋亡标志性蛋白Bax、Caspase-3的表达，减少CA1区神经细胞凋亡，抑制缺血缺氧造成的神经损伤，具有神经保护作用。HNG神经保护作用可能与激活STAT3上调抗凋亡MCL-1的转录有关，与增加SOCS3的表达有关，需要进一步的实验研究证实。 第二部分 S14G-humanin对SH-SY5Y细胞氧糖剥夺/复氧损伤的保护作用及机制研究 目的: 研究使用SH-SY5Y神经母细胞瘤细胞建立体外氧糖剥夺/复氧(OGD/R)模型，模拟体内脑卒中的缺血/再灌注损伤。评估HNG潜在的神经保护作用，并进一步确定相关保护作用的分子机制，为HNG用于治疗脑缺血再灌注损伤提供理论依据。 方法: 1.细胞培养和干预 对SH-SY5Y细胞进行OGD/R实验，并给予不同剂量HNG干预治疗。FLLL32、LY294002和MK-22062HC1分别是JAK2、 PI3K和AKT抑制剂，这些抑制剂被添加到细胞实验中。 2.细胞活性检测 SH-SY5Y细胞活性测定采用CCK-8细胞计数试剂盒，用Synergy HT酶标仪测得每孔450nm光密度值。 3.细胞凋亡率分析 用FITC AnnexinⅤ凋亡检测试剂盒检测SH-SY5Y细胞的凋亡率。细胞凋亡的程度应用双激光流式细胞仪和ModFit LT软件分析。 4.SH-SY5Y细胞超氧物歧化酶(superoxyde dismutase，SOD)活性和测量甲烷二醛(methane dicarboxylic aldehyde，MDA)浓度的检测SOD活性:应用SOD活性检测试剂盒检测。通过测定450nm光密度值对WST-8产物进行分析，然后计算WST-8产物的抑制率就可测定SOD的活力。MDA测定:取1 mLSH-SY5Y细胞裂解上清液置于2.5 mLEP管中，加1 mL0.6％硫代巴比妥酸。EP管置于沸水中静置15min，然后放置在冰中降温，然后测量光密度值。 5.免疫印迹分析 应用RIPA细胞裂解液提取总蛋白，10％或12％SDS聚丙烯酰胺凝胶分离，转移到PVDF膜。然后用以下一抗标记蛋白质:Jak2、p-Stat3(Y705)、p-Stat3(S727)、Cytochrome C、Bax、Caspase3和β-actin。洗膜后，放入辣根过氧化物酶标记的二抗稀释液中室温下孵育2h。测定膜上印迹光学密度值。 结果: 1.OGD/R导致SH-SY5Y细胞存活率显著降低(P＜0.05)，给予1、5或10μg/L HNG孵育的SH-SY5Y细胞比无HNG治疗的OGD/R细胞有更高的细胞存活率(P＜0.05)。OGD/R也导致SH-SY5Y细胞凋亡率显著增加(P＜0.05)，添加HNG的细胞凋亡减少(P＜0.05)。这些数据表明HNG对OGD/R状态的神经细胞有细胞保护和抗凋亡作用。 2.OGD/R过程中SH-SY5Y细胞的SOD活性减少(P＜0.01)。给予1、5或10μ g/L HNG的细胞SOD的活性增加(P＜0.05)，其峰值在1μg/L。OGD/R过程中SH-SY5Y细胞中MDA含量明显的增长(P＜0.01），给予1，5或10μg/L HNG后抑制MDA浓度的增加(P＜0.05）。结果表明HNG抑制OGD/R诱导的抗氧化能力的降低和氧化物的产生。 3.与对照组比较，OGD/R降低JAK2蛋白水平(P＜0.05)，降低p-state3(Y705)蛋白(P＜0.05)。给予HNG治疗的细胞表达JAK2(P＜0.05)和p-state3(Y705)(P＜0.05)蛋白水平增加。而且，给予5和10μ g/L HNG的细胞表达JAK2(P＜0.01)、p-state3(Y705)(P＜0.01)和p-state3(S727)(P＜0.05)蛋白水平有更显著的增加。 4.HNG逆转了由OGD/R降低的细胞存活率(P＜0.05)，HNG抑制OGD/R导致的细胞凋亡率增加（P＜0.05），同时给予flll32则废除了HNG对细胞凋亡的抑制作用。OGD/R上调细胞色素C、Bax和cleaved caspase-3蛋白水平(P＜0.05)，HNG抑制OGD/R诱导的这些蛋白的表达上调(P＜0.05），而fill32阻断了HNG的这种抑制作用。数据表明HNG通过激活JAK2/STAT3信号有效抑制OGD诱导的细胞凋亡。 5.HNG增加OGD/R细胞Jak2蛋白的表达，PI3K(LY294002;P＜0.05)和AKT(MK-22062HCl;P＜0.05)抑制剂下调Jak2蛋白的表达。HNG上调p-State3(Y705)蛋白的表达，给予FLLL32共孵育明显减少其表达(P＜0.01)。PI3K(P＜0.05)和AKT(P＜0.05)抑制剂也降低p-State3(Y705)蛋白的表达。给予FLLL32(P＜0.05)、 LY294002(P＜0.05)以及MK-22062HCl(P＜0.01)都能降低p-State3(S727)蛋白的表达。这些数据表明HNG激活Jak2/State3信号是通过PI3K/AKT信号通路。 结论: 这些数据表明HNG具有抑制OGD/R损伤的神经保护作用，首次确认机制是通过PI3K/AKT通路激活JAK2/STAT3信号。HNG激活JAK2/STAT3信号抑制氧化应激和线粒体功能障碍诱导的凋亡。表明HNG是很有希望用于治疗脑卒中的药物。