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目的:过敏性休克(anaphylactic shock,AS)能够引起严重的、威胁生命的全身多系统速发过敏反应。最近的研究表明,全世界因药物、食物等过敏原诱发的严重过敏反应的事件逐年增加,其中医疗过程中因使用药物引起的过敏性休克致人死亡的案件通常会引发医疗纠纷。这些案件经尸体解剖和病理组织学检验,通常难以发现特异性改变。因此,过敏性休克死亡案件的诊断是法医实际鉴定工作中的一大难题。在法医学实践工作中,必须在排除致死性疾病、中毒及其它机械性损伤等死亡原因的基础上,需结合死者抗原接触史、过敏史、临床症状和体征、尸体解剖及病理组织学检查所见才可做出过敏性休克死亡的诊断。发现可靠的过敏性休克诊断指标与准确简便的诊断方法,是当前法医病理学重要研究内容。Toll样受体(Toll-like receptors,TLRs)属于模式识别受体(pattern recognition receptors,PRRs)家族,识别高度保守的微生物组分-病原相关分子模式(pathogen-associated molecular patterns,PAMPS),对病原体产生特异性免疫应答。Toll样受体2(Toll-like receptor 2,TLR2)可见于心血管系统、呼吸系统、生殖系统、消化系统、神经系统等,主要表达于单核细胞、巨噬细胞、中性粒细胞及肥大细胞,在脾脏和外周血白细胞中呈高表达。Toll样受体4(Toll-like receptor 4,TLR4)的分布较广,可见于血管内皮细胞、单核细胞、中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、肥大细胞、肠上皮细胞、呼吸道上皮细胞。有报道已证明TLR2和TLR4在一些自身免疫疾病中起相关作用。TLR2对人类肥大细胞活化过程中起不同程度的调节作用,而TLR4在促进特异性细胞免疫应答、激活肥大细胞、促进中性粒细胞迁移和单核细胞中白三烯的合成方面有重要作用。在卵清蛋白介导的过敏性气道疾病模型中TLR2、TLR4及髓样分化因子88(myeloid differentiation factor88,MyD88)对肺泡灌洗液中嗜酸性粒细胞的积聚起各自不同的作用。TLR2和TLR4也是引起气道高反应性(airways hyperresponsiveness,AHR)的关键分子。本研究将探讨过敏性休克死亡豚鼠在不同保存条件下组织中TLR2和TLR4表达的变化,为过敏性休克的诊断提供辅助诊断指标。研究方法:健康成年豚鼠60只,体重250g~300g,适应性饲养一周后剩余豚鼠56只,分为对照组及实验组。实验组再分为过敏性休克死亡即刻组、冷藏48h组(4℃)、冷冻7d组(-20℃),室温12h组(20℃~23℃)、室温24h组、室温48h组、室温72h组7个亚组,每组7只。适应性饲养一周后,各实验组豚鼠于后脚掌皮下注射0.1mL稀释后人混合血清(人混合血清:生理盐水=1:10),对照组用等量生理盐水代替。普食喂养两周,实验组于心腔内注射1mL稀释后人混合血清,激发过敏反应。对照组用生理盐水代替。提取喉头、气管、肺、胃和肠组织。部分组织固定用于制作石蜡切片,进行组织学检查。应用显微图像分析技术观察TLR2和TLR4的表达情况。提取肺组织,使用高通量组织研磨器研磨,通过Western blot、ELISA实验,检测TLR2和TLR4的表达情况,并应用qRT-PCR检测TLR2mRNA、TLR4 mRNA的变化情况。结果:经HE染色,发现实验组动物喉头、气管、肺、胃及肠充血、水肿,可见大量嗜酸性粒细胞浸润。对照组无明显改变。免疫组织化学染色的结果显示,TLR2和TLR4阳性细胞主要表达于喉头、气管的黏膜下层,肺间质以及胃壁与肠壁的黏膜层和黏膜下层,死亡即刻组豚鼠组织中TLR2阳性细胞数明显增多,与对照组比较有统计学差异(p<0.05);各实验组中豚鼠喉头、气管、肺、胃及肠中TLR4阳性细胞数明显增多,与对照组比较有统计学差异(p<0.05),各实验组之间无统计学差异。运用免疫荧光双染色对表达TLR2和TLR4的细胞进行定位,发现肥大细胞均表达两种受体。通过Western blot检测发现,死亡即刻组豚鼠肺组织中TLR2蛋白表达量较对照组增多,且有统计学意义(p<0.05);各实验组豚鼠肺组织中TLR4蛋白表达量明显高于对照组,有统计学意义(p<0.05),各实验组之间无统计学差异。ELISA检测显示,死亡即刻组肺组织中TLR2、TLR4表达明显高于对照组,差异有统计学意义(p<0.05)。应用qRT-PCR检验,结果显示死亡即刻组、冷藏组、冷冻组豚鼠肺组织中TLR2 mRNA表达高于对照组,具有统计学意义(p<0.05);各实验组豚鼠肺组织TLR4 mRNA表达均高于对照组,具有统计学差异(p<0.05)。各实验组之间TLR2 mRNA、TLR4 mRNA表达无差异。结论:1、过敏性休克死亡豚鼠喉头、气管、肺、胃、肠组织中TLR2和TLR4蛋白表达明显增加,可能作为过敏性休克的辅助诊断指标。2、环境温度对TLR4蛋白的检出影响较小,提示TLR4较稳定,较TLR2具有更大的过敏性休克的法医学诊断价值。