第一部分NYD-SPl4一个新的TPR结构域样蛋白的功能研究目的:通过研究一个本实验室发现的全新TPR样结构基因NYD-SP14及其与其他蛋白的相互作用,以进一步探讨NYD-SP14可能的生物学功能和在精子和肿瘤发生和发展过程中的作用机制。方法:构建一系列NYD-SP14、PP2A的A亚单位以及C亚单位、HRB2、HSP70、HSP90酵母表达载体、荧光表达载体和原核表达载体。通过RT-PCR分析NYD-SP14在多组织中差异性表达研究NYD-SP14与睾丸发育的关系。采用酵母双杂交技术和GST pulldown实验验证NYD-SP14与PP2A的A亚单位(PP2R1A)以及C亚单位(PP2AC)、HRB2、HSP70、HSP90的相互作用以及这些相互作用的明确位点,通过序列比对及与之相互作用的蛋白质推断NYD-SP14可能的生理学功能已经一步研究。通过体外原核细胞表达出NYD-SP14蛋白,纯化获得单一的His-NYD-SP14蛋白,将纯化好的NYD-SP14蛋白免疫Babla/C小鼠获得NYD-SP14多克隆抗体。NYD-SP14、HRB2荧光表达质粒转染HELA细胞稳定筛选后观察NYD-SP14、HRB2这两个在研究中发现的新的蛋白质在HELA细胞的表达定位。通过免疫组化观察NYD-SP14在睾丸及浸润性乳腺癌组织中的表达。结果:通过RT-PCR分析不同发育时期小鼠睾丸中NYD-SP14的表达量研究NYD-SP14与睾丸发育的关系,以证明该基因与细胞增殖相关。RT-PCR表明NYD-SP14在睾丸强表达于其他组织。酵母双杂交和GST pulldown验证NYD-SP14与HRB2、PP2A-A亚单位PP2R1A、PP2A-C亚单位(PP2AC)、HSP70、HSP90相互作用,而NYD-SP14包含的三联的TPR结构域对于这些相互作用是必需的,其中HRB2是一个从未被报道过的人KRR1蛋白质,这为研究SP14的功能和作用机制指明了方向。NYD-SP14与PP2R1A不同片段酵母双杂交共转染显示NYD-SP14的272～387氨基酸和PP2R1A的183-463氨基酸是必须的。通过定点突变实验,已证明了HSP70和HSP90未端的EEVD序列是与NYD-SP14结合所必须的。成功地构建了HELA细胞的GFP-NYD-SP14、GFP-HRB2稳定转染细胞株。绿色荧光蛋白的亚细胞定位试验,提示NYD-SP14在HELA细胞中,可定位于胞浆中,而HRB2在细胞分裂不同过程定位于不同的地方。结论:本实验室分离并获得一个新基因NYD-SP14,生物信息学分析表明NYD-SP14的N末端含有一个单独TPR结构域和由三个连续的TPR结构域组成的TPR结构区,提示NYD-SP14属于TPR样基因,其编码的蛋白很可能具有TPR样蛋白的生物学功能。NYD-SP14在睾丸和高度恶性的浸润性乳腺癌中高表达,提示NYD-SP14可能与细胞增殖相关,并有可能是一种肿瘤-睾丸(CT)基因。另外,本研究还表明NYD-SP14可以与HRB2、PP2R1A、PP2AC、HSP70、HSP90相互作用,NYD-SP14在细胞的发生过程中,可能起到一种桥梁作用,沟通起HRB2、PP2R1A、PP2AC、HSP70、HSP90这些似乎没有什么必然关系的蛋白间的相互作用,共同调节细胞的周期生长。这些研究有助于揭示精子和乳腺癌发生发展的分子机制,更为研发新的乳腺癌治疗药物提供理论指导。这些结果显示,HRB2的表达高低,不仅仅是参与40S核糖体的形成,可能还是细胞分裂的直接启动者。同时,也说明了,SP14、HRB2、PP2A Aa和HSP70所形成的复合物,可能参与调控了细胞的分裂。第二部分TPR样蛋白介导的蛋白与蛋白相互作用的作用机制研究目的:通过研究一系列包含有三联TPR的TPR样蛋白与PP2R1A、PP2AC、HSP70、HSP90的相互作用以及它们相互作用的明确位点,构建TPR样蛋白介导的蛋白与蛋白相互作用图,进一步分析TPR样蛋白与PP2R1A、PP2AC、HSP70、HSP90的相互作用的作用机制。方法:构建64个包含有TPR结构域的TPR样蛋白基因全长及单独的三联TPR结构域突变体的酵母表达载体及GST-表达质粒。通过酵母双杂交和非同位素标记的GST pulldown实验验证这些TPR样蛋白与PP2R1A、PP2AC、HSP70、HSP90和HSP70与HSP90共同的C末端的EEVD结构的突变体的相互作用,构建以TPR样蛋白为中心的蛋白与蛋白相互作用图,进一步分析包含有三联TPR结构域的TPR样蛋白介导的蛋白与蛋白相互作用的机制和构建一种研究TPR样蛋白和进一步研究PP2R1A、PP2AC、HSP70和HSP90蛋白的模式。结果:成功构建64种包含有三联TPR结构域的TPR样蛋白的酵母表达质粒。运用上述质粒与PP2R1A、PP2AC、HSP70和HSP90酵母表达质粒进行酵母共转染的双杂交实验,其中52种蛋白及其单独的三联TPR结构域区域突变体蛋白可以PP2R1A、PP2AC、HSP70和HSP90相互作用。构建这64种蛋白及其单独的三联TPR结构域区域突变体蛋白的GST-表达载体,通过非同位素标记的GST-pulldown实验验证了酵母双杂交的结果。结论:本研究共发现52种新的TPR样蛋白质与PP2R1A、PP2AC、HSP70、HSP90相互作用,因此推测对于包含有三联TPR的TPR样蛋白而言,它们和PP2A的相互作用具有普遍意义。另外,这些发现为研究与PP2R1A、PP2AC、HSP70、HSP90的作用的新的相互作用底物提供了一种新的研究模式。