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食源性致病菌是导致食品安全问题的重要生物性因素,严重危害着人类的健康。耐药性食源性致病菌的产生,不仅增加了医疗的难度和负担,而且能够在食物链中传播,导致细菌耐药性问题的加剧。在食品工业中,大部分致病微生物主要以生物被膜的形式粘附在食品加工机械表面,这些生物被膜不但影响食品安全,而且被视为与细菌耐药性的形成有密切相关性,能够帮助细菌抵御外界抗生素的侵袭,增加疾病治疗的难度,造成严重的经济损失和社会负担。然而现阶段,关于细菌生物被膜耐药性的探索多聚焦于临床研究领域,对于食源性致病菌生物被膜耐药机制的研究相对较少。明晰生物被膜中食源性致病菌耐药性的产生规律,有助于更好地控制食源性致病菌的危害。因此,本研究针对食源性致病菌生物被膜与耐药性两大食品安全重点、难点问题,首先,运用Meta分析技术探究了全球食源性致病菌生物被膜与耐药性的流行与分布,并进一步选取副溶血性弧菌作为研究对象,分析了浮游态与被膜态副溶血性弧菌的耐药差异,最后运用激光共聚焦显微镜、胞外聚合物裂解酶处理、转录组学技术,全面系统的揭示了副溶血性弧菌生物被膜抵抗氨基糖苷类抗生素的耐药机制。本研究的主要研究内容及结果如下:1.Meta分析揭示全球食源性致病菌耐药性与生物被膜流行情况为更好地了解全球食源性致病菌耐药性和生物被膜的形成情况与分布,明晰食源性致病菌耐药性形成规律与机制的共性问题。本研究通过电子资源数据库的文献收集,获得了来自36个国家的332组研究数据,运用Meta分析等统计学方法,对全球食源性致病菌耐药性及生物被膜的相关研究进行汇总与多元分析。结果表明,非洲和南美洲地区分离的食源性致病菌耐药性水平明显高于其他三个洲。在全球,食品分离株的耐药率均高于10%,其中对β-内酰胺酶类抗生素的耐药性最强,蜡状芽孢杆菌的耐药性高达94%。所有临床分离株的耐药率均大于19%,与食品分离株相比,对各类抗生素的耐药性更强。食源性致病菌的总体生物被膜形成率为90%(95%CI,68%-96%),且生物被膜形成与抗生素耐药性(游离态)之间没有直接的线性关系。本研究首次运用meta分析揭示了食源性致病菌耐药性和生物被膜的全球流行情况,为生物被膜中食源性致病菌耐药机制的揭示奠定了扎实的数据基础。2.副溶血性弧菌耐药性与生物被膜形成能力的相关性研究本研究进一步选取副溶血性弧菌作为研究对象,分析了其耐药性与生物被膜形成能力的相关性。采用微量肉汤稀释法和本研究首次构建的生物被膜耐药性测定方法,分别测定了32株游离态和被膜态的副溶血性弧菌对8种常见抗生素的耐药程度。并结合结晶紫染色法,揭示了副溶血性弧菌生物被膜的形成能力,最后对其耐药性与生物被膜的相关性进行了研究。通过Spearman相关性分析,发现游离态副溶血性弧菌的耐药性(MIC)与其生物被膜形成能力不存在相关性(pvalue>0.05),验证了本文第二章Meta分析的相关结果。而被膜态副溶血性弧菌对氨基糖苷类的阿米卡星(AK)耐药性(BIC),与生物被膜形成能力呈正相关(p-value<0.01)。进一步比较分析发现,被膜态菌株的耐药性显著高于浮游态菌株,其中对氨基糖苷类抗生素的抗性差异最为明显,但具体作用机制尚属研究空白,有待后续深入系统的研究。3.副溶血性弧菌生物被膜对氨基糖苷类抗生素的耐药机制研究为探究副溶血性弧菌生物被膜对氨基糖苷类抗生素的耐药机制,本文首先借助激光共聚焦显微镜,分析了副溶血性弧菌生物被膜的微观结构特性,并将其与耐药性进行了相关性分析。并针对生物被膜主要成分e DNA和胞外蛋白,采用关键酶(DNase I和酶蛋白酶K)对被膜菌进行处理,探究处理前后耐药性变化。最后对游离态和被膜态副溶血性弧菌进行转录组测序,分析其基因表达调控的差异。结果显示,副溶血性弧菌生物被膜的生物体积(BV)和平均厚度(AT),与其被膜态的阿米卡星耐药性(BIC)呈显著正相关,Spearman相关系数分别为0.813、0.642;BV与被膜态的副溶血性弧菌对庆大霉素的耐药性存在一定的相关性(p-value<0.05)。经关键酶处理后,被膜态副溶血性弧菌对氨基糖苷类抗生素的耐药性明显减小,其中DNase I处理更为显著。经转录组测序分析,副溶血性弧菌形成生物被膜之后,共有724个基因表达显著上调,260个基因下调,其中阴离子转运和ABC转运系统功能通路基因差异表达明显。经综合分析,本文初步揭示了生物被膜中副溶血性弧菌氨基糖苷类耐药性的形成机制:(1)抵抗机制:副溶血性弧菌通过增加生物被膜的生物体积、平均厚度等参数,产生氨基糖苷类抗生素耐药性;(2)消减机制:副溶血性弧菌生物被膜中阴离子胞外多聚物能够与阳离子的抗生素相结合,以消减抗生素的侵袭,从而产生耐药性。(3)调控机制:副溶血性弧菌形成生物被膜之后,其ABC转运系统、阴离子转运的表达显著上调,有助于促进耐药性的形成。