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[目的] 一、研究藤黄酸(GA)对慢性髓性白血病(CML) K562细胞株的抑制增殖、诱导凋亡和自噬的作用,及其对BCR/ABL融合基因的影响,探讨在该作用下凋亡和自噬的关系。 二、凋亡和自噬相关蛋白在弥漫大B细胞淋巴瘤(DLBCL)病理组织中的表达及其对预后的意义。 [方法] 一、不同浓度和时间的GA作用于K562细胞和正常骨髓单个核细胞(MNC),采用CCK-8法检测细胞活性;光镜和AnnexinⅤ/PI双染法观察细胞的凋亡;通过透射电镜(TEM)、单丹磺酰尸胺(MDC)、Western blot方法检测K562细胞的自噬。实时荧光定量PCR(real time PCR)和荧光原位杂交(FISH)检测K562细胞的BCR/ABL融合基因的表达。 二、采用免疫组化方法(IHC)检测60例RCHOP方案化疗的DLBCL患者的病理标本中Beclin1、Bcl2、MYC和Ki67蛋白的表达。 [结果] 一、 1.GA呈时间和浓度依赖性地抑制K562细胞的增殖。其作用12、24、36和48h的IC50分别为2.27、1.50、1.16和1.04μM,其抑制率与时间和浓度的相关指数(r)分别为0.739和0.972(P均<0.05)。另一方面,GA对正常骨髓MNC的毒性较K562细胞株明显减弱(P<0.05),对应抑制K562细胞的各浓度和时间组的GA作用于MNC的抑制率均小于10%。 2.GA诱导K562细胞凋亡,光镜下细胞出现典型的凋亡形态学改变,0.5、1.0和2.0μM GA作用K562细胞24h的早期凋亡率、晚期凋亡率和总凋亡率均随着作用浓度的升高而增高,且与对照组的差异均有统计学意义(P<0.05),其三种凋亡率和GA的浓度均呈显著相关,r分别为0.941,0.864和0.919(P均<0.05)。而同样浓度的GA作用于MNC的总凋亡率均<20%,1.0μM的 GA作用K562细胞和MNC的总凋亡率分别为54%和9.5%,其对K562细胞的凋亡率是MNC的5.7倍(P<0.05)。 3.GA诱导K562细胞自噬,在TEM下,1.0μM GA作用的K562细胞较对照组出现典型的自噬小体,MDC显示荧光数量增多、强度增强,自噬蛋白Beclin1和LC3-Ⅱ的表达以及LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的比值均较对照组显著增加(P<0.05)。 4.随着GA作用浓度的增高,K562细胞BCR/ABL融合基因的表达明显下降(P<0.05)。 5.加用自噬抑制剂氯喹抑制自噬后,GA诱导凋亡的作用较单用GA组明显减弱(P<0.05);而加用泛半胱氨酸蛋白酶(pan-caspase,PC)抑制剂Z-VAD-FMK抑制凋亡后,GA诱导自噬的作用明显减弱(P<0.05)。 二、 1.60例DLBCL患者,3年预期总生存率(OS)在MYC高表达组和低表达组为57%和96%(P<0.05); Ki67高表达组和低表达组的OS为80.3%和90.3%(P>0.05);Bcl2高表达组和低表达组的OS为59.8%和90.3%(P<0.05);Beclin1高表达组和低表达组的OS为82.3%和76.8%(P>0.05)。 2.3年预期无进展生存率(PFS)在MYC高表达组和低表达组为50%和96%(P<0.05);Ki67高表达组和低表达组的PFS为75.3%和90.3%(P>0.05);Bcl2高表达组和低表达组的PFS为69.3%和80.8%(P<0.05);Beclin1高表达组和低表达组的PFS为83.1%和68.3%(P>0.05)。 3.在双重打击的联合危险分层模式中,MYC+Bcl2双阳性组和非双阳性组的3年预期OS分别为53.8%和92.8%(P<0.05),3年预期PFS分别为46.3%和87.8%(P<0.05),多因素分析显示MYC+Bcl2双阳性是3年预期OS的独立预后因素(P<0.05)。 4.在MYC+IPI的联合危险分层模式中,高危组(高IPI[3-5分]且MYC高表达)、中危组(高IPI或MYC高表达)和低危组(低IPI[0-2分]且MYC低表达)的3年预期OS分别为47.8%,81.3%和98.8%(P<0.05),3年预期PFS分别为41.8%,73.3%和97.3%(P<0.05),多因素分析显示高IPI+MYC高表达是3年预期OS和PFS的独立预后不良指标(P<0.05)。而在单用IPI进行危险分层的模式中,高危组(IPI4-5)、中危组(IPI2-3)、低危组(IPI0-1)的3年预期OS分别为81.3%,79.3%和99.8%(P>0.05),其3年预期PFS分别为60.8%,75.8%和99.8%(P>0.05)。 [结论] 一、 1.在对正常骨髓MNC无明显影响的浓度下,GA对K562细胞具有抑制增殖和诱导凋亡的作用。 2.GA对K562细胞有诱导自噬的作用。 3.GA下调K562细胞BCR/ABL融合基因的表达。 4.在GA的作用下,K562细胞的自噬和凋亡相互依赖/促进,抑制自噬使凋亡减少,抑制凋亡导致自噬减弱。 1.MYC高表达、Bcl2高表达、MYC+Bcl2双阳性及高IPI+MYC高表达均是DLBCL患者生存的预后不良因素。 2.MYC高表达、高IPI+MYC高表达是DLBCL生存的独立的预后不良因素。 3.MYC联合IPI的危险分层模式较单用IPI模式能更加准确地判断DLBCL患者的预后。