基因支持着生命体的基本构造和性能,基因序列稳定性的维护是遗传信息完整传承和细胞生存的至关重要的条件,在DNA复制过程中复制叉的建立和其在染色体上移动的精确控制确保了基因序列的稳定。在细胞周期S期中,DNA进行复制合成,复制体复合物沿着染色体移动决定活化的复制叉的功能。在整个复制过程中,MCM2-7,GINS和Cdc45蛋白共同组装成一个具有解旋酶活性的复合物来解旋双链DNA。已有研究揭示了Cdc45-MCM-GINS(CMG)复合体的分子结构,结合最近的研究发现Cdc45蛋白沿着染色体运动的方式与MCM不同,但Cdc45蛋白是如何沿着染色体移动的并且这种移动对CMG复合体功能的影响,我们知之甚少。泛素化修饰是蛋白的翻译后修饰之一,是指泛素分子与细胞内目标蛋白相结合并对目标蛋白进行特异性修饰的过程。蛋白的泛素化修饰在蛋白质的定位、代谢、功能、调节和降解中都起着十分重要的作用。本研究发现在酿酒酵母中,Cdc45蛋白能够被单泛素化修饰,依据生物信息学分析,我们发现Cdc45蛋白存在10个潜在的泛素化修饰位点,然而这些位点中是否存在泛素化修饰位点?以及形成泛素化后是否会对Cdc45蛋白功能产生影响?目前还未见报道。在本文研究中,我们发现染色体上结合的Cdc45在S期能够被泛素化,并受泛素化连接酶Dia2和去泛素化酶Doa4的双重调控,从而调节其在CMG复合体中的功能。同时,我们还确定了Cdc45的两个泛素化位点:K156和K643。当这两个位点突变时,Cdc45不能被泛素化。我们研究了Cdc45泛素化对细胞周期的影响,通过流式细胞术实验发现,Cdc45泛素化突变体细胞或敲除Doa4的酵母细胞生长缓慢,S期延长;但两者同时突变时,细胞的生长速度有一定程度的恢复。HU(hydroxyurea,羟基脲)是一种DNA复制抑制剂,Cdc45泛素化突变体和Doa4敲除的细胞都呈现对HU的敏感,而两者双突变的细胞对HU的敏感程度比单突变低。我们进一步研究了Cdc45泛素化对复制叉的稳定性的影响。Rad52蛋白与细胞重组修复密切相关,能够修复和重启损伤或停滞的复制叉,当细胞复制叉坍塌时,Rad52会聚集形成Rad52 foci;在Cdc45泛素化位点突变体中,Rad52 foci明显增加,说明细胞存在内源性DNA损伤。此外,Rad53是酵母细胞内一个重要的DNA损伤检查点,当DNA发生损伤时,细胞通过不同途径磷酸化Rad53,启动下游的损伤修复基因,修复损伤;我们在突变体细胞从G1期释放的第40分钟检测到磷酸化的Rad53,意味着细胞内复制叉出现停滞。RPA是单链DNA(ss DNA)结合蛋白,能稳定DNA复制和修复过程中产生的ss DNA区域,RPA-SSDNA的大量累积会激活ATR损伤修复通路;突变体中RPA foci的显著增加,表明细胞存在大量额外的ss DNA。这些结果说明Cdc45不能泛素化时,细胞中DNA复制存在缺陷,复制叉出现坍塌,导致内源性DNA损伤。我们进一步发现Cdc45泛素化突变体细胞中结合在染色体上的MCM和GINS组分减少,而Doa4敲除的细胞中MCM量增加,但两者的Cdc45的量都保持不变;在之前的研究中表明,在Mcm2/Mcm5之间有一个“门”,前延链有可能从MCM环中滑出,而Cdc45能够抓住滑出的DNA。为此,我们提出泛素化修饰能够调节Cdc45的功能,抓住意外从MCM环中滑出的前延链并将其送回,从而稳定复制叉,保证复制体沿着染色体正常移动,这为深入理解Cdc45在DNA复制中的作用提供了新的线索和思路。基于以上结果与结论,Cdc45蛋白的泛素化修饰可确保复制体复合物沿着染色体正常移动,并且维护复制叉的稳定,保证复制的正常进行,泛素化的Cdc45充当着一个“复制完整性密码”的作用。