论文部分内容阅读
IFN-β是由干扰素诱生剂诱导生物细胞后所产生的高活性多功能蛋白，参与抗病毒、抗增殖和免疫反应，在保持体内平衡和宿主防御方面起作用，自被发现后一直是细胞因子基础和临床研究的前沿。本实验应用15L生物反应器悬浮微载体培养CHO细胞，表达分泌人干扰素-β1a（Human Interferon-β1a，rIFN-β1a），建立rhIFN-β的纯化工艺并进行质量分析。细胞培养收获液经超滤浓缩5倍，小试纯化工艺初级纯化采用蓝胶亲和层析和锌螯合亲和层析两种方法对比。通过考查洗脱缓冲液盐离子浓度和极性还原剂浓度，探索了蓝胶亲和层析分离rhIFN-β1a的最佳条件，结果表明纯化最佳条件为：洗脱Ⅰ组成为20mmol/L Tris-HCl （pH7.2），2mol/L NaCl，洗脱Ⅱ组成为20mmol/L Tris-HCl （pH7.2），2mol/L NaCl，50%丙二醇。考查锌螯合亲和层析洗脱缓冲液咪唑浓度进行纯化条件优化，结果表明纯化最佳条件为：洗脱液组成为20mmol/L磷酸钠（pH7.4）-30mmol/L咪唑-0.5mol/L NaCl。SDS-PAGE表明蓝胶亲和层析较锌螯合亲和层析纯化rhIFN-β1a效果好，初级纯化采用蓝胶亲和层析法。纯化的rhIFN-β1a经G-25脱盐，采用CM阳离子交换除去杂蛋白，洗脱液组成为20mmol/L柠檬酸-柠檬酸钠（pH5.0），1mol/LNaCl，SDS-PAGE分析纯度可达到95%，rhIFN-β1a平均比活为1.11×108IU/mg，蛋白平均活性回收率为17.94%。将小试纯化工艺放大20倍到中试规模，结果表明蓝胶亲和层析重复性好，与小试结果基本一致。以Tris-HCl（pH8.0）为缓冲液，精制纯化改为Q阴离子交换层析，SDS-PAGE及HPLC分析纯度达到95%，rhIFN-β1a平均比活性可达到4.08×107IU/mg，蛋白平均活性回收率为39.7%。采用VSV病毒抑制法测定效价、Lowry法测定蛋白含量、等电聚焦电泳法测定等电点、SDS-PAGE和HPLC鉴定纯度、Western blot法分析免疫活性、质谱仪测定分子量。Western blot结果表明经CHO表达的rhIFN-β1a与天然产物特异性一致。蛋白质分子量为20.4kDa，等电点为pH6.6，与国家标准品基本一致。本文确立了rhIFN-β1a蛋白纯化工艺流程，为建立大规模制备rhIFN-β1a的纯化工艺，研制出符合国家药典要求的rhIFN-β1a奠定了基础。