论文部分内容阅读
海蜇（Rhopilema esculentum）隶属于刺胞动物门、钵水母纲、根口水母目、海蜇属,作为一种大型的可食用经济水母,在我国海洋渔业中占有重要地位。其基础生物学研究深入,人工繁育、增养殖技术成熟,是研究水母发育过程基因表达调控及水母毒素组成、结构和功能的理想模式生物。本研究在454转录组测序的基础上,通过EST序列分析、c DNA末端快速扩增（RACE）技术从刺胞动物门的海蜇中克隆获得两个磷脂酶A2基因c DNA全长序列（命名为Re PLA2-1、Re PLA2-2）、两个穿孔蛋白基因c DNA全长序列（命名为Re PFP-1、Re PFP-2）,并对这些基因进行了原核表达及重组蛋白功能分析。详细结果信息如下:1、Re PLA2-1基因c DNA全长为824bp,开放阅读框（ORF）504bp,能够编码167个氨基酸。预测Re PLA2-1的分子式为C833H1283N235O241S15,推测的半衰期为30h,不稳定指数为61.93,属于不稳定蛋白。亲水性平均数（GRAVY）为-0.124,推测该蛋白为水溶性蛋白。根据氨基酸序列预测的分子量和等电点分别是18.93KDa和8.02。Re PLA2-2基因c DNA序列全长840bp,预测的开放阅读框（ORF）包含495个核苷酸,编码165个氨基酸序列。N-端前23个核苷酸为信号肽,5’非编码区（UTR）和3’非编码区UTR分别包含6个核苷酸和336核苷酸。预测Re PLA2-2的分子式为C844H1278N228O232S13,分子量和等电点分别是18.747KDa和8.94。推测的半衰期为30h,不稳定指数为32.64,属于稳定蛋白。亲水性平均数（GRAVY）为-0.276,推测该蛋白为水溶性蛋白。利用overlap PCR技术,获得了Re PLA2-1、Re PLA2-2基因组全长序列。Re PLA2-1基因组序列全长2937bp,由4个外显子和3个内含子。Re PLA2-2基因组序列全长2113bp,由2个外显子和1个内含子组成。Blast比对结果显示,Re PLA2-1、Re PLA2-2属于PhospholipA23家族。系统进化分析表明,Re PLA2-1、Re PLA2-2与僧袍芋螺、星状海葵、长牡蛎毒素PLA2聚为GIX PLA2一支,与GXIII、GXII PLA2家族成员共聚为pfam-collection。荧光定量PCR显示,蜇Re PLA2-1、Re PLA2-2基因在海蜇不同发育阶段均有表达。其中,Re PLA2-1在海蜇水螅体发育阶段及横裂体发育阶段具有较高表达量。在横裂体发育阶段Re PLA2-1 m RNA达到四个发育阶段的最高值,为碟状体阶段的12.2倍;其次为水螅体体阶段,为水碟状体阶段的7.6倍;水母体阶段也达到了碟状体阶段的5.5倍。Re PLA2-2在海蜇水母体、碟状体发育阶段具有较高表达,分别为横裂体阶段的10.8倍和4.4倍。在水螅体阶段表达量为横裂体阶段表达量的1.3倍,无明显差异。以海蜇c DNA为模板,设计特异性引物扩增Re PLA2成熟肽部分,进行原核表达。重组蛋白以包涵体的形式表达,经纯化、透析复性后获得的重组蛋白能够水解大豆卵磷脂。2、获得的海蜇Re PFP-1 c DNA全长2303bp,包含1883bp的开放阅读框,能够编码610个氨基酸,3’UTR包括一个多腺苷酸Poly（A）尾和一个多腺苷酸化加尾信号AATAAA。Re PFP-1基因组全长5786bp,由7个外显子6个内含子组成,所有内含子外显子的剪切位点均符合GT-AG剪切规则。Re PFP-2 c DNA全长2212bp,包含1842bp的开放阅读框,编码613个氨基酸,3’UTR包括一个多腺苷酸Poly（A）尾和一个多腺苷酸化加尾信号AATAAA。Re PFP-2基因组全长8609bp,由8个外显子7个内含子组成,所有内含子外显子的剪切位点均符合GT-AG剪切规则。Re PFP-1和Re PFP-2之间氨基酸序列相似率为65%,都含有N端MACPF结构域,与其他穿孔蛋白不同的是Re PFP-1和Re PFP-2蛋白C端均含有一个卵黄膜外层蛋白I结构域（VMO I）。将Re PFP-1和Re PFP-2与穿孔素、补体等含MACPF结构域穿孔蛋白家族成员氨基酸序列进行进化分析,结果表明Re PFP-1和Re PFP-2氨基酸序列与原生生物聚为一簇。利用实时荧光定量PCR技术,我们对Re PFP-1和Re PFP-2m RNA在海蜇水螅体、横裂体、碟状体和幼水母体四个典型发育阶段进行了相对表达量检测,结果表明,尽管Re PFP-1和Re PFP-2在海蜇四个发育阶段都具有表达,但在早期发育水螅体阶段有明显的表达上调,而在幼水母体阶段表达量较低。因此,结合VMOI在其他生物卵子发生过程中的作用我们推测Re PFP-1和Re PFP-2蛋白可能并不仅是作为毒素起作用,还可能参与海蜇早期发育的调控。在Re PFP-1和Re PFP-2 MACPF结构域两端分别设计引物,以海蜇c DNA为模板扩增海蜇PFP蛋白MACPF结构域部分,并构建原核表达重组质粒pet28-Re PFP-1和pet28-Re PFP-2,将重组质粒转化到表达菌株BL21（DE3）感受态细胞,并实现了重组表达。但是,重组表达的蛋白经纯化、透析复性后并无抑菌活性。