论文部分内容阅读
研究目的:胰岛素抵抗(IR)是2型糖尿病(T2DM)等多代谢性疾病的病理生理学基础,IR的发生发展与机体脂代谢异常密切相关。有氧运动可通过增加骨骼肌代谢相关基因的表达促进脂肪酸有氧氧化,减少骨骼肌脂毒性,从而改善IR。但有氧运动如何调节代谢相关基因表达机制尚不清楚。组蛋白去乙酰化酶5(HDAC5)在有氧运动介导的骨骼肌肌纤维类型转换中的重要作用。肌肉增强因子2(MEF2)的转录活性受到HDAC5的抑制,许多代谢相关基因含有与MEF2增强子区域结合的保守序列,推测运动可能通过HDAC5/MEF2调节代谢相关基因的表达。肉碱棕榈酸转移酶1(CPT1b)被认为长链脂肪酸(LCFA)进入线粒体唯一的限速酶,在增加骨骼肌长链脂肪酸β-氧化,减少脂毒性中起关键作用;CPT1b基因启动子区域含有MEF2保守结合位点,运动是否通过HDAC5/MEF2增强CPT1b基因表达尚不清楚。HDAC5受一磷酸腺苷活化蛋白激酶(AMPK)的调控,AMPK是细胞内的能量感受器,运动可以通过激活AMPK Thr172位点的磷酸化引起其下游信号通路的活化,促进脂肪β-氧化。综上所述,本课题的研究目的为:(1)明确有氧运动是否可以调节正常及IR小鼠骨骼肌HDAC5活性;(2)明确HDAC5是否参与脂肪酸有氧氧化的关键蛋白CPT1b的表达调控;(3)探讨运动是否通过AMPK介导HDAC5活性的变化;本课题为有氧运动在调节骨骼肌代谢相关基因及其在改善IR中的作用机制提供理论基础。研究方法:实验动物选用4周龄C57BL/6雄性小鼠,经过10周高脂饮食建立IR小鼠模型,之后将小鼠分为正常饮食安静组(NC),正常饮食运动组(NE),高脂饮食安静组(HC)和高脂饮食运动组(HE),运动组小鼠进行为期6周的有氧跑台训练。口服葡萄糖耐量试验(OGTT)检测小鼠葡萄糖耐量;提取血清,检测空腹血清胰岛素(FIN)及血脂水平;油红O染色检测小鼠骨骼肌脂质异位沉积;酶动力学检测小鼠骨骼肌柠檬酸合酶(CS)活性;Western blot检测小鼠骨骼肌HDAC5,p HDAC5 Ser259,p HDAC5 Ser498,Ac-H3K9,AMPKα、p AMPKαThr172,CPT1b蛋白表达水平;Real time PCR检测小鼠骨骼肌CPT1b m RNA水平;分离小鼠骨骼肌胞浆胞核蛋白,检测胞浆胞核中HDAC5的蛋白含量;利用免疫共沉淀技术检测HDAC5分别与14-3-3,MEF2A,AMPKα,p AMPKαThr172蛋白的结合;染色质免疫共沉淀(CHIP)分别检测小鼠骨骼肌MEF2A,HDAC5与CPT1b基因启动子的结合;构建MEF2A,HDAC5过表达质粒及含有CPT1b启动子的荧光素报告基因质粒,转染C2C12细胞,分别检测CPT1b m RNA表达水平及荧光素酶活性;利用AMPK激动剂AICAR,AMPKα2及其显性负突变DN-AMPKα2腺病毒处理C2C12肌管细胞,Western blot检测HDAC5,p HDAC5 Ser259,p HDAC5 Ser498,AMPKα,p AMPKαThr172蛋白表达水平;野生型或AMPKα2基因敲除小鼠分为安静组和运动组,运动组小鼠进行为期1小时的有氧跑台训练,Western blot检测小鼠骨骼肌HDAC5,p HDAC5 Ser259,p HDAC5 Ser498,AMPKα1,AMPKα2,p AMPKαThr172,p Ca MKII Thr286,p PKD Ser744/748蛋白表达水平。研究结果:(1)6周有氧跑台训练可以增加小鼠骨骼肌有氧氧化能力,降低由高脂饮食诱导的小鼠体重增加,改善受损的葡萄糖耐量,逆转由高脂饮食引起的高胰岛素血症及脂质代谢紊乱等症状,改善骨骼肌脂质异位沉积;(2)6周有氧跑台训练可以增加正常及IR小鼠骨骼肌p HDAC5 Ser259/498,p AMPKαThr172位点磷酸化水平,促进骨骼肌HDAC5磷酸化依赖的出核效应,减少HDAC5与MEF2A的结合,增加HDAC5与AMPK的结合,同时增加骨骼肌H3K9的乙酰化水平,增加骨骼肌CPT1b m RNA和蛋白表达水平。(3)6周有氧跑台训练可以增加正常及IR小鼠骨骼肌MEF2A与CPT1b基因启动子的结合,减少HDAC5与CPT1b基因启动子的结合;在C2C12肌管细胞中,HDAC5可抑制MEF2A介导的CPT1b m RNA表达及含CPT1b启动子荧光素酶活性的升高;AMPK的激动剂AICAR可以激活AMPK-HDAC5信号通路,过表达AMPKα2及其显性负突变DN-AMPKα2可分别激活或抑制AMPK-HDAC5信号通路;(4)单次有氧跑台运动可以激活野生型小鼠骨骼肌AMPK-HDAC5信号通路;AMPKα2缺失状态下,单次有氧运动对小鼠骨骼肌HDAC5 Ser259/498磷酸化水平无显著影响;AMPKα2缺失小鼠较野生型小鼠骨骼肌HDAC5 Ser259/498磷酸化水平升高,其上游激酶PKD Ser744/748磷酸化水平也显著升高,。研究结论:有氧运动可以有效改善由高脂饮食引起的小鼠糖脂代谢异常,这与运动介导的HDAC5的磷酸化出核效应密切相关;HDAC5可以通过MEF2A抑制CPT1b基因转录活性,有氧运动可以调节骨骼肌HDAC5/MEF2A与CPT1b启动子的相互作用,推测有氧运动可能通过HDAC5/MEF2A调节CPT1b的表达,从而改善骨骼肌脂质异位沉积。有氧运动可以激活骨骼肌AMPK-HDAC5信号通路,但AMPK的缺失会阻断运动增加骨骼肌HDAC5的磷酸化水平,同时增加PKD的代偿作用,提示AMPK在运动介导的HDAC5活性调节中发挥重要作用。