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肺纤维化(PF)多发于中老年人群,随着我国步入老龄化社会,PF患病人数逐年增加。然而,PF目前并无有效药物治疗措施,因此,抗PF药物的研发迫在眉睫。土槿乙酸(PAB)是从中药土槿皮中分离出的主要成分之一,具有独特的双环二萜结构。前期研究表明,PAB具有显著的抗炎和免疫抑制作用。鉴于炎症和异常免疫在PF中扮演着重要角色,本课题旨在研究PAB抗实验性PF的作用,并探讨其作用机制,为其后续应用奠定基础。目的:利用转化生长因子-β1(TGF-β1)诱导的人胚肺成纤维细胞(HELF)PF模型和博莱霉素(BLM)诱导的小鼠PF模型,探究PAB的抗PF作用及其作用机制。方法:1.TGF-β1诱导的HELF细胞PF模型的建立将HELF细胞接种于孔板中,自然贴壁后吸去孔内液体,分别加入DMEM稀释的TGF-β1 0、5、10、15、20μg/L,与HELF细胞共孵育12、24或48h后,进行Western Blot或MTT检测。根据α-SMA的表达和细胞增殖率确定合适的TGF-β1诱导浓度和时间。2.PAB对TGF-β1诱导的HELF细胞PF模型的作用将HELF细胞接种于孔板中,分为对照(NC)、吡非尼酮(PFD)、PAB低剂量(PABL)、PAB高剂量(PABH)、TGF-β1模型(TGF-β1)、TGF-β1+吡非尼酮(TGF-β1+PFD)、TGF-β1+PAB低剂量(TGF-β1+PABL)和TGF-β1+PAB高剂量(TGF-β1+PABH)组,培养24 h后,前四组加DMEM,后四组加DMEM稀释的TGF-β1 10μg/L,再培养24 h。用DMEM稀释PFD和PAB后,弃去各孔内液体,NC和TGF-β1组加DMEM,PFD和TGF-β1+PFD组加PFD溶液0.5μM,PABL和TGF-β1+PABL组加PAB溶液0.5μM,PABH和TGF-β1+PABH组加PAB溶液1μM,培养24 h。MTT法检测细胞生存率。Western Blot检测CollagenⅠ、CollagenⅢ和α-SMA蛋白表达。3.PAB对TGF-β1诱导的HELF细胞PF模型的机制TGF-β1诱导的HELF细胞PF模型按上述分组进行PFD或PAB加药处理24 h后,收集各组蛋白,用Western Blot检测Smad2/3、p-Smad2/3、Smad4、Smad7、IκBα、p-IκBα、NF-κB p65、p-NF-κB p65和IL-6的表达。4.PAB对BLM诱导的小鼠PF模型的作用雄性昆明种小鼠75只,随机分5组:NC、BLM、PFD、PABL和PABH组,单次气管内滴注BLM 5 mg/kg造模。造模后第二日灌胃给药,每日一次,给药21天。PFD组给予PFD 50 mg/(kg·d),PABL和PABH组分别给予PAB2.5和5 mg/(kg·d),NC和BLM组给予等体积生理盐水。第21天时,小鼠内眦取血0.5 mL后安乐死,离心得血清。小鼠右肺中叶用4%多聚甲醛固定后制成病理切片,并进行H&E和Masson染色。小鼠其余肺组织置于液氮中快速冷冻,用于Western Blot。5.PAB对BLM诱导的小鼠PF模型的机制提取PF小鼠肺组织蛋白,Western Blot检测TGF-β1、Smad2、p-Smad2、Smad7、NF-κB p65和p-NF-κB p65的表达。ELISA测定PF小鼠血清中IL-17A和IL-6水平。免疫组化法检测PF小鼠肺组织切片中IL-17A和IL-6的表达。结果:1.TGF-β1诱导的HELF细胞PF模型的建立与NC组相比,TGF-β1 10、15、20μg/L与HELF细胞共孵育24或48 h均可显著上调α-SMA的表达。后续实验选用TGF-β1 10μg/L刺激HELF细胞24 h的方法诱导HELF细胞PF模型。2.PAB对TGF-β1诱导的HELF细胞PF模型的作用PAB 0.5和1μM与HELF细胞共孵育24 h,未对HELF细胞产生细胞毒性。与TGF-β1组比,TGF-β1+PABL和TGF-β1+PABH组显著降低了细胞生存率(P<0.01),并下调了CollagenⅠ、CollagenⅢ和α-SMA的蛋白表达(P<0.01)。3.PAB对TGF-β1诱导的HELF细胞PF模型的机制与TGF-β1组相比,TGF-β1+PABL和TGF-β1+PABH组显著抑制了Smad2/3、IκBα和NF-κB p65的磷酸化产物表达(P<0.01),下调了Smad4和IL-6(P<0.01),上调了Smad7(P<0.01)。4.PAB对BLM诱导的小鼠PF模型的作用与BLM组相比,PABL和PABH组均显著减轻了炎性浸润,减小了肺泡间隔增宽,抑制了胶原沉积,下调了α-SMA的表达(P<0.01)。5.PAB对BLM诱导的小鼠PF模型的机制与BLM组相比,PABL和PABH组显著下调了TGF-β1的表达(P<0.01),抑制了Smad2和NF-κB p65的磷酸化产物表达(P<0.01),上调了Smad7的表达(P<0.01),降低了IL-17A和IL-6的水平(P<0.01)。结论:1.成功建立TGF-β1诱导的HELF细胞PF模型和BLM诱导的小鼠PF模型。2.PAB 0.5和1μM对TGF-β1诱导的HELF细胞PF模型有抑制作用;PAB2.5和5 mg/(kg·d)对BLM诱导的小鼠PF模型有抑制作用。3.在TGF-β1诱导的HELF细胞PF模型中,PAB显著上调了Smad7的表达,下调了Smad4和IL-6的表达,抑制了Smad2/3、IκBα和NF-κB p65的磷酸化。4.在BLM诱导的小鼠PF模型中,PAB显著降低了IL-17A和IL-6水平,下调了TGF-β1的表达,上调了Smad7的表达,抑制了Smad2和NF-κB p65的磷酸化。