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梨作为我国三大水果之一,在国民经济中占据重要地位。2020年中国的梨产量约为1700万吨,其中砀山梨的产量接近100万吨。砀山梨为我国四大名梨之首,是我国颇具代表性的梨果产品,用砀山梨生产梨酒对增加果农收入、发展区域经济和丰富果酒市场种类都具有重要意义。目前阻碍砀山梨酒产业化的关键问题是砀山梨酒在生产过程中极易发生褐变,褐变会导致梨酒质量产生不可逆转的缺陷,发生褐变以后的砀山梨酒的颜色很难被消费者接受。目前缺乏对砀山梨酒褐变机理的深入研究,亦没有对砀山梨酒的褐变实现有效的调控。通过考察影响砀山梨酒氧化褐变的关键因子,确定导致砀山梨酒褐变的关键内源物质,深入阐释砀山梨酒的褐变机理。其次通过多步骤筛选、诱变及驯化,获得高产谷胱甘肽（Glutathione,GSH）酿酒酵母、通过孢子固定化酶技术获得孢子固定化谷胱甘肽还原酶（Glutathione reductase,GR）,将二者结合应用于砀山梨酒的发酵和储存,提高酒体的抗氧化能力,有效控制砀山梨酒褐变的发生。同时发现与酿酒酵母胞外GSH产量相关的新基因,为进一步提高酿酒酵母胞外GSH产量提供参考。论文主要结论如下:（1）考察不同溶解氧浓度（Dissolved oxygen concentration,DOC）对梨酒氨基酸含量、总酚含量、还原糖含量、多酚氧化酶（Polyphenol oxidase,PPO）活性、过氧化物酶（Peroxidase,POD）活性、苯丙氨酸解氨酶（Phenylalanine ammonia lyase,PAL）活性、褐变度的影响,及各理化指标和褐变度之间的关系。进行梨酒储存过程中理化指标变化的动态模型拟合分析,不同溶解氧梨酒中的总酚含量、氨基酸含量、POD活性、高溶解氧样品中的DOC、中溶解氧及低溶解氧样品中的褐变度、高溶解氧及中溶解氧样品中的还原糖含量随储存时间的变化满足零级反应模型;低溶解氧样品中的还原糖含量（0-7周）随储存时间的变化满足一级反应模型;中溶解氧及低溶解氧样品中的DOC、低溶解氧样品中的还原糖含量（7-15周）随储存时间的变化满足分数转换反应模型;高溶解氧样品中的褐变度随储存时间的变化满足抛物线反应模型。通过正交偏最小二乘判别法（Orthogonal partial least squares discriminant,OPLS）分析各理化指标对梨酒褐变影响的重要程度,结果表明,溶解氧、总酚和氨基酸含量对梨酒褐变度影响最大。砀山梨酒的褐变是由非酶褐变所主导,主要是酚类物质的氧化聚合和氨基酸参与的美拉德反应。（2）为了鉴定影响梨酒褐变的关键化合物,基于LC/MS技术,对褐变前后的梨酒样品进行非靶向差异代谢组学分析。共发现196种显著差异代谢物,其中22种可能与梨酒褐变有关。褐变的模拟实验结果显示,涉及D-（+）-葡萄糖、L-苯丙氨酸、L-正亮氨酸、蛋氨酸、D-（+）-脯氨酸、芦荟甙和芦丁的梨酒褐变产生2种黄色色素和3种红色色素。导致砀山梨酒褐变的主要原因是芦荟甙的氧化聚合,和D-（+）-葡萄糖、L-正亮氨酸、蛋氨酸参与的美拉德反应。砀山梨酒中芦荟甙的氧化聚合形成蒽醌是导致砀山梨酒褐变的重要代谢途径之一。芦荟甙和葡萄糖聚合生成5-羟基芦荟大黄素甙A或7-羟基芦荟大黄素甙B,两分子的5-羟基芦荟大黄素甙A或7-羟基芦荟大黄素甙B发生聚合生成Elgonica-dimer A。5-羟基芦荟大黄素甙A和7-羟基芦荟大黄素甙B既是芦荟甙氧化聚合的中间体,也是褐变后梨酒的呈色化合物。（3）通过酵母分离、产气能力测试、嗅觉测试、梨酒理化指标测试和挥发性香气成分分析的多步骤筛选策略,从新鲜砀山梨和腐烂砀山梨果实上获得5株综合发酵品质优良的酿酒酵母。分别用5株自筛菌株和5株常见的商业酿酒酵母酿造砀山梨酒,其中自筛菌株JN3、JN32和商业菌株SY、DV10及71B酿造梨酒的综合品质最好。对上述5株酿酒酵母进行MNNG化学诱变及H2O2抗性驯化,得到高产GSH酿酒酵母JN32-9,其GSH的胞外产量为37.62 mg·L-1,比初发菌株高出47.47%。JN32-9所产的GSH可以有效保护梨酒中的D-葡萄糖、L-正亮氨酸、D-脯氨酸、芦荟甙和芦丁免受氧化。以商业酿酒酵母作为对照,JN32-9酿造、初始溶解氧为2.20 mg·L-1的梨酒样品,储存13周后,褐变度降低27.68%。且JN32-9酿造的砀山梨酒酒体丰满、口味纯正,风味化合物的总含量为2456.41μg·L-1。（4）对酿酒酵母JN32和JN32-9进行基因组重测序分析,分析结果显示MAL31、MPH2和HXT13等基因与酿酒酵母胞外GSH产量有一定的联系。在酿酒酵母JN32中高表达MAL31、MPH2和HXT13基因后,酿酒酵母的胞外GSH产量分别提高了23.41%、21.53%和24.85%。分子模拟对接结果显示MAL31、MPH2和HXT13基因编码的膜蛋白可能是酿酒酵母胞内GSH向胞外输出的潜在通道,GSH和MAL31、MPH2和HXT13基因编码蛋白的氨基酸残基以氢键相互作用,进而被运输到胞外。（5）将GR编码基因高表达于野生型酿酒酵母wt和孢子壁缺陷型酿酒酵母osw2△,dit1△和chs3△,并诱导各酵母产孢,其中chs3△孢子固定化GR（chs3△-GR）具有最高的酶活性,为3.08 U·mg-1·min-1。chs3△-GR的最适反应温度为40℃,最适反应pH为5.0,对蔗糖、葡萄糖、柠檬酸、乙醇和蛋白酶K有一定抗性。将chs3△-GR添加到JN32-9酿造的砀山梨酒中进行储存,chs3△-GR会进一步防止梨酒中D-葡萄糖、L-正亮氨酸、D-脯氨酸、芦荟甙和芦丁的氧化。与储存初期的梨酒相比,加入chs3△-GR的梨酒的褐变度仅增加了17.86%,而对照组商业酿酒酵母SY酿造的梨酒的褐变度增加了65.18%,chs3△-GR和高产GSH酿酒酵母JN32-9的综合使用将梨酒的褐变度降低了47.32%,有效地延缓了砀山梨酒褐变的发生。