论文部分内容阅读
目的:研究Connexin26(Cx26)对非小细胞肺癌(Non-small-cell lung cancer,NSCLC)上皮间质化(epithelial–mesenchymal transition,EMT)和吉非替尼获得性耐药的影响及其分子机制。方法:1.用蛋白免疫印迹(Western blot,WB)、RT-PCR(reverse transcription PCR)法检测4种缝隙连接蛋白(Connexins,Cxs)Cx26、Cx32、Cx31.1及Cx43在4株人NSCLC细胞系HCC827、PC9、A549、NCI-H1299中的表达水平。2.用诱导耐药的方法,在人NSCLC细胞系HCC827、PC9的培养基中,按浓度梯度逐步增加吉非替尼浓度,以1.0μM的吉非替尼终浓度维持细胞耐药性,构建吉非替尼诱导耐药株HCC827 GR和PC9 GR细胞。使用噻唑蓝(Tetrazolium-based colorimetric assay,MTT)法检测以上细胞的半数抑制浓度(Half maximal inhibitory concentration,IC50)值。3.用荧光示踪法(parachute assay)检测人NSCLC细胞株HCC827、PC9及其诱导耐药株HCC827 GR、PC9 GR细胞间的缝隙连接功能(gap junctional intercellular communication,GJIC);使用免疫荧光技术(Immunofluorescence staining,IF)检测NSCLC细胞株HCC827、PC9及其诱导耐药株HCC827 GR、PC9 GR细胞中Cx26的蛋白定位。4.用慢病毒(lentivirus)载体技术对人NSCLC细胞中Cx26蛋白表达进行干扰和过表达;用pcDNA3.1-Akt质粒转染对人NSCLC细胞中Akt蛋白进行过表达,用PI3K/Akt特异性抑制剂LY294002对Akt蛋白表达进行抑制;用wb检测人nsclc细胞中cx26、e-cadherin、vimentin、slug、akt及p-akt的表达水平。使用transwell小室法检测人nsclc细胞的迁移、侵袭能力。5.balb/c裸鼠分别皮下接种200μl1×107个hcc827、hcc827gr、hcc827gr-shcx26细胞。当肿瘤体积((长×宽2)/2)达到100mm3时,分别给予吉非替尼(100mg/kg/d,灌胃)或ly294002(25mg/kg,腹腔注射,一周2次)或联合给药。给药作用15天后处死裸鼠,每3天测量一次肿瘤体积,绘制肿瘤增殖曲线。结果:1.wb和rt-pcr结果显示,在4株人nsclc细胞系hcc827、pc9、a549、nci-h1299中,cx26、cx32、cx31.1和cx43的表达具有差异性,其中cx26是主要表达的cxs亚型,并且cx26在吉非替尼耐药细胞株a549、nci-h1299中表达均高于吉非替尼敏感细胞株hcc827、pc9。2.mtt结果显示,hcc827、hcc827gr和pc9、pc9gr细胞对吉非替尼的ic50值分别为0.06±0.11μm、12.17±0.18μm及0.25±0.07μm、16.51±0.17μm。形态学显示,hcc827gr、pc9-gr细胞表现分散、细长、间质样细胞形态;上皮标志物e-cadherin表达减少,间质标志物vimentin、slug的表达增多;transwell实验结果显示,hcc827gr、pc9-gr细胞的迁移、侵袭能力显著增强;wb结果显示,hcc827gr、pc9gr细胞中cx26的表达量显著增多。3.荧光示踪法结果显示,以人包皮成纤维细胞(hffs)作为阳性对照,hffs细胞用ra(gjic增强剂)处理后能够显著增强细胞间的gjic功能。但是hcc827、hcc827gr和pc9、pc9gr细胞间缝隙连接功能缺失,用ra处理后并未能增强细胞间的gjic功能。免疫荧光结果显示,cx26表达在hcc827、pc9及hcc827gr、pc9gr细胞胞浆。4.在吉非替尼敏感株hcc827、pc9细胞上过表达cx26后,hcc827-cx26、pc9-cx26细胞表现分散、细长、间质样细胞形态;上皮标志物e-cadherin表达减少,间质标志物vimentin、slug的表达增多;transwell实验结果显示,hcc827-cx26、pc9-cx26细胞的迁移、侵袭能力显著增强。mtt结果表明,hcc827-cx26、pc9-cx26细胞对吉非替尼的耐药性显著增高。体内成瘤实验显示,与hcc827-mock、pc9-mock组相比,过表达cx26使hcc827、pc9组肿瘤体积显著增大。5.在对吉非替尼耐药的hcc827gr、pc9gr细胞上干扰cx26的表达后,hcc827gr-shcx26、pc9gr-shcx26细胞的分散、细长、间质样细胞形态被部分逆转;上皮标志物e-cadherin表达上调,间质标志物vimentin、slug的表达下降;transwell实验结果显示,hcc827gr-shcx26、pc9gr-shcx26细胞的迁移、侵袭能力显著减弱。mtt结果表明,hcc827gr-shcx26、pc9gr-shcx26细胞对吉非替尼的敏感性显著增高。体内成瘤实验显示,与hcc827gr-scramble、pc9gr-scramble组相比,干扰cx26使hcc827gr、pc9gr组肿瘤体积增大被部分逆转。6.wb结果显示,在对吉非替尼敏感的hcc827、pc9细胞中过表达cx26后,p-akt的表达量显著增多;在对吉非替尼耐药的hcc827gr、pc9gr细胞中干扰cx26后,p-akt的表达量显著降低。用ly294002处理hcc827-cx26、pc9-cx26细胞后,形态学结果显示,ly294002能够部分逆转上述细胞的间质样转变;上皮标志物e-cadherin表达增多,间质标志物vimentin、slug的表达减少;transwell实验结果显示,ly294002能够拮抗过表达cx26对hcc827、pc9细胞的促迁移和促侵袭效应。mtt结果表明,ly294002能够拮抗过表达cx26对hcc827、pc9细胞对吉非替尼的耐药性。体内成瘤实验显示,与hcc827-mock、pc9-mock组相比,ly294002处理后能够抑制过表达cx26引起的hcc827、pc9组的肿瘤体积的增大。7.在HCC827、PC9细胞中过表达Akt后,HCC827、PC9细胞表现出分散、细长、间质样细胞形态;上皮标志物E-cadherin表达减少,间质标志物vimentin、slug的表达增多;Transwell实验结果显示,过表达Akt后HCC827、PC9细胞的迁移、侵袭能力显著增强。MTT结果显示,过表达Akt后HCC827、PC9组对吉非替尼的敏感性显著降低。在过表达Akt的HCC827、PC9细胞中进一步过表达Cx26蛋白后,能进一步增强上述效应。而在过表达Akt的HCC827、PC9细胞中干扰Cx26蛋白的表达后,能够部分拮抗上述效应。此外,WB结果显示,在HCC827、PC9、HCC827GR、PC9 GR细胞用特异性PI3K/Akt通路抑制剂LY294002抑制PI3K/Akt通路活性后,Cx26的表达下降;在上述细胞中用质粒瞬转过表达Akt后,Cx26的表达随之增多。结论:Cx26上调与非小细胞肺癌吉非替尼获得性耐药呈正相关;Cx26与PI3K/Akt信号通路之间的相互激活促进EMT介导的非小细胞肺癌吉非替尼获得性耐药,且该过程独立于GJIC作用。