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研究背景丙型肝炎病毒(Hepatitis C virus,HCV)感染是全球范围内慢性肝病的重要原因。据世界卫生组织统计,全球HCV感染者有1.3亿至1.5亿人,HCV感染高度慢性化,在相当长时间内并不引起明显症状,且疾病进展缓慢,很多感染者不能及时接受诊断和治疗,因而在确诊时就已发展为肝硬化和肝癌。在中国也约有1000万丙肝患者,且近十多年来,每年新确诊的丙肝病例呈增长趋势。无需联合干扰素的新一代直接抗病毒药物(direct acting antiviral agents,DAAs)对于丙肝在较短的疗程即可获得极高的治愈率,成为丙肝治疗的革命,但耐药性以及长期有效性方面仍需要根据更多的临床数据进行评估。HCV感染高度慢性化的发生机制一直病毒学领域的研究热点,近年来,发现了HCV通过与系列宿主因子的相互作用,实现免疫逃避,以及在调控细胞增殖和细胞病变之间的平衡。我们前期对HCV感染的人肝癌细胞Huh7细胞进行了转录组测序,鉴定出了多种被HCV感染显著上调表达的宿主基因,其中包括乙酰胆碱酯酶(acetylcholine esterase,AchE)基因。胆碱能系统除了与中枢神经记忆、学习密切相关外,越来越多的研究也发现在非神经性组织细胞中也存在着胆碱能系统成分的表达,并且参与增殖分化等细胞基本功能,还与血管形成、炎症反应、免疫调节等生物功能有关,这部分胆碱能系统被称作非神经性胆碱能系统(non-neurogenic cholinergic system,NNCS)。本研究拟探讨HCV感染上调AchE表达的生物学意义。研究目的本研究拟寻找非神经性胆碱能系统(NNCS)与HCV感染之间的联系,希望能从新的角度推进对HCV感染与宿主细胞互作以及免疫逃避机制的认识,为研发新的抗HCV药物提供线索,并为认识其他正链RNA病毒的感染与致病机制提供参考。研究方法利用乙酰胆碱检测试剂盒分别检测HCV感染Huh7细胞以后,胞内、胞外乙酰胆碱(acetylcholine,Ach)溶度的变化,通过用AchE抑制剂处理Huh7细胞,或用siRNA下调AchE的表达水平,明确胞内Ach在乙酰胆碱酯酶(acetylcholine esterase,AchE)催化作用下对HCV感染细胞的影响;用Ach处理细胞,然后用蛋白免疫印迹法和qPCR法检测凋亡标志分子caspase 3的裂解以及炎症因子MCP-1、TNF-?、IL1?的表达,明确胞外的Ach是否通过作用于细胞表面的乙酰胆碱受体(acetylcholine receptor,AchR)从而影响细胞凋亡和炎症反应。用AchE抑制剂处理Huh7细胞,观察其对脂筏分布以及对霍乱毒素细胞侵入的影响,用蔗糖梯度高速离心提取脂筏,检测脂筏标志分子Caveolin 2的分布,通过对脂筏染色以及探索AchE是否通过影响脂筏的形成,从而调控HCV的细胞侵入。用AchE抑制剂处理Vero细胞,检测其是否影响寨卡病毒(ZIKV)和西尼罗病毒(WNV)的感染。研究结果及结论HCV感染Huh7细胞36 h后,胞内胆碱能代表性蛋白分子表达都明显升高,胞内的Ach溶度保持相似的低水平,而胞外的Ach溶度在HCV感染后上升。用AchE抑制剂降低AchE酶活性以及用siRNA下调AchE蛋白表达,均明显降低HCV对Huh7细胞的感染。用Ach处理Huh7细胞,凋亡分子caspase 3并不发生裂解,但胞内炎症因子MCP-1、TNF-?的mRNA表达水平升高。对Huh7细胞预先用α7nAchR受体拮抗剂处理,再用Ach处理细胞,此时炎症因子MCP-1、TNF-?的mRNA表达水平明显升高。用AchE抑制剂处理Huh7细胞后提取和检测脂筏,未发现脂筏含量的变化。用AchE抑制剂处理Vero细胞也明显降低了ZIKV和WNV的感染。综上结果,HCV感染Huh7细胞后能上调AchE的表达以及增强AchE的酶活性,AchE表达的增加和酶活性增强都能促进HCV的感染,因而AchE在HCV感染Huh7细胞的过程中起着正反馈增强感染的作用。AchE增强HCV感染不是通过影响对HCV细胞侵入高度依赖的细胞膜脂筏的含量而实现。AchE可能通过降解Ach抑制细胞的炎症反应,从而更有利于HCV的感染,这可能是AchE增强HCV感染的可能原因(之一)。AchE对于其他黄病毒感染也发挥类似作用。结果提示,AchE-Ach可能作为抗黄病毒感染的干预靶点。