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研究背景:脑卒中(stroke)是全世界致残率以及死亡率的主要原因之一,其中在所有的卒中类型中,缺血性脑卒中占87%左右。当前,临床治疗急性缺血性脑卒中的主要方法是尽快注射rt-PA进行静脉溶栓,恢复脑缺血区组织再灌注。但静脉溶栓治疗时间窗较短(3 h),再灌注的同时又会加重脑组织的病理损害,造成缺血再灌注损伤,故缺血性脑卒中仍是心脑血管领域研究的热点。脑缺血再灌注损伤病理机制复杂,研究发现,氧化应激和细胞凋亡在脑缺血所致的继发性脑损伤中发挥重要作用。氧化应激的发生主要与内源性抗氧化还原系统失衡有关,其中转录因子NF-E2相关因子2(NF-E2-related factor 2,Nrf2)及其下游作用因子血红素加氧酶-1(heme oxygenase-1,HO-1)在内源性抗氧化还原系统平衡的维持中起着重要作用。当细胞受到氧化应激刺激时,Nrf2发生核易位并可促进HO-1及其他内源性抗氧化物酶的蛋白表达,表现出显著的抗氧化应激效应。而抑制Nrf2/HO-1信号通路,可降低细胞的抗氧化应激效应,同时可显著减弱相关抗氧化药物的神经保护疗效。研究表明,细胞凋亡在脑缺血再灌注损伤的病理过程中同样发挥关键作用。当脑组织发生缺血再灌注损伤时,促凋亡蛋白表达增加,抗凋亡蛋白表达下降,细胞凋亡率及脑梗死体积显著升高;而抑制凋亡可以减少缺血再灌注大鼠脑组织的梗死体积,改善神经功能评分。因此,寻找具有抗氧化应激和抗凋亡活性的药物,可能会为缺血性卒中提供潜在的治疗策略。现代研究发现,柿叶具有清热解毒、润肺强心、镇咳止血、抗癌防癌等多种医疗保健功能。柿叶黄酮提取物(Flavonoid components extract from Diopyros Kaki,FLDK)作为柿叶的主要有效成分同样具有多种生物学效应,如对抗癌症发生、抑制氧化损伤以及改善并加强心脑血管的理化功能等。本课题组前期实验表明,在体内,FLDK可减少APP/PS1转基因小鼠脑组织中β-淀粉样蛋白(amyloid beta protein,Aβ)的过度沉积,抑制氧化应激及炎症反应,提高认知功能;在体外,柿叶提取物可抑制HEK293-APPswe转基因细胞的氧化应激反应,减少Aβ1-42的沉积和聚集,对神经细胞具有明显的保护效应。但目前,在脑缺血再灌注损伤中,有关FLDK是否发挥神经保护作用的研究甚少。离体细胞氧糖剥夺/再灌注(oxygen-glucose deprivation/reperfusion,OGD/R)模型作为脑缺血再灌注损伤的体外模型,可较好地模拟在体情况下细胞的损害过程,且能排除体内诸多因素的干扰,可以较为直接、准确地了解缺血再灌注后细胞功能及调控机制的变化。因此,本研究通过建立OGD/R介导的HT22细胞损伤模型,观察FLDK的神经保护作用,并对其可能的分子生物学机制进行初步探讨。研究目的:1、观察柿叶黄酮提取物对OGD/R损伤的HT22细胞是否具有神经保护作用。2、探讨柿叶黄酮提取物是否是通过激活PI3K/Akt/GSK-3β信号通路发挥抗氧化应激和抗凋亡作用的。方法:1筛选合适的氧糖剥夺时间HT22细胞被随机分成4组:正常对照组(Control组),氧糖剥夺1h/再灌注24 h组(OGD(1 h)/R(24 h)组),氧糖剥夺3 h/再灌注24 h组(OGD(3 h)/R(24h)组),氧糖剥夺 6h/再灌注 24h 组(OGD(6h)/R(24h)组)。采用CCK-8法检测细胞活性,以筛选合适的OGD时间。2确定FLDK的安全浓度范围,筛选合适的有效浓度向常规培养的HT22细胞中加入不同浓度的FLDK(0,1,5,10,20,50,100,200μg/mL)共培养24h,使用CCK-8法检测细胞活性,确定药物的安全浓度范围;之后建立OGD/R损伤模型,加入安全浓度范围内的药物,采用CCK-8法联合乳酸脱氢酶(LDH)法共同筛选合适的有效浓度,用于后续试验。3观察FLDK对OGD/R损伤所致HT22细胞氧化应激的影响将HT22细胞随机分为正常对照组(Control组),OGD/R组,OGD/R+FLDK治疗组(FLDK+OGD/R组)。参照说明书用硫代巴比妥酸法测定丙二醛(malondialdehyde,MAD)含量,水溶性四唑盐法测定超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase,SOD)活性,二硫代二硝基甲苯酸法测定谷腕甘肽过氧化物酶(Glutathione peroxidase,GSH-Px)活性,2’,7’-二氯荧光黄双乙酸盐(2’,7’-dichlorodihydrofluorescein diacetate,DCFH-DA)荧光探针检测胞内活性氧(ROS)水平。4观察FLDK对OGD/R损伤所致HT22细胞凋亡的影响将HT22细胞随机分为正常对照组(Control组),OGD/R组,OGD/R+FLDK治疗组(FLDK+OGD/R组)。流式细胞仪分析法测定细胞凋亡率,四甲基罗丹明乙酯(tetramethylrhodamine methyl ester,TMRM)和罗丹明 123(rhodamine 123,Rh123)染色法共同检测线粒体膜电位(Mitochondrial membrane potential,MMP)变化,Western-blotting 法检测 cleaved caspase-3,caspase-8,cleaved caspase-9,cleaved PARP,Bax,Bcl-2及细胞色素c(cyt-c)等相关蛋白的表达。5观察FLDK对PI3K/Akt/GSK-3β信号通路的影响将HT22细胞随机分为正常对照组(Control组),OGD/R组,OGD/R+FLDK治疗组(OGD/R+FLDK组),LY294002(PI3K特异性抑制剂)组(OGD/R+FLDK+LY组),各组细胞处理结束,采用Western-blotting法检测Akt,p-Akt,GSK-3β,p-GSK-3β 蛋白表达。6探讨FLDK发挥神经保护作用的可能分子机制将HT22细胞随机分为正常对照组(Control组),OGD/R组,OGD/R+FLDK治疗组(OGD/R+FLDK组),TDZD-8(GSK-3β特异性抑制剂)组(OGD/R+FLDK+TDZD-8组),各组细胞处理结束,参照以上测定方法,分别检测氧化应激相关指标(ROS及MAD含量,SOD及GSH-Px活性,Nrf2和HO-1蛋白表达)变化,检测凋亡相关指标(cleaved caspase-3,caspase-8,cleaved caspase-9蛋白表达及细胞凋亡率)变化。结果:1筛选合适的氧糖剥夺时间与Control组相比,OGD时间为1 h,细胞活性下降不明显(P>0.05);OGD时间为3 h和6 h,细胞活性分别下降至Control组的(45.4 ± 12.9)%和(37.1 土9.4)%(P<0.05)。故本实验选取OGD时间为3 h用于后续试验。2 FLDK安全浓度确定及合适有效浓度筛选不同浓度的FLDK(1～200 μg/mL)分别作用于常规培养的HT22细胞24 h。当FLDK浓度为0～50μg/mL时对细胞活性无影响(P>0.05),当FLDK浓度≥100μg/mL时,细胞活性明显下降(P<0.05),故确定FLDK(0～50μg/mL)为药物安全浓度。对HT22细胞进行OGD/R损伤处理后加入安全浓度范围内的药物,细胞活性和LDH漏出率测定结果显示,当FLDK浓度为20μg/mL时对细胞的保护活性最强,故选FLDK≤20μg/mL用于后续试验。3 FLDK对OGD/R损伤所致HT22细胞氧化应激的影响与Control组相比,OGD/R损伤后ROS水平及MDA含量增加,SOD及GSH-Px活性下降(P<0.05);FLDK治疗组较OGD/R组ROS及MDA含量下降,SOD及GSH-Px活性增强(P<0.05),表明,FLDK可抑制OGD/R损伤介导的HT22细胞氧化应激。4 FLDK对OGD/R损伤所致HT22细胞凋亡的影响与Control组相比,OGD/R损伤后细胞凋亡率及促凋亡相关蛋白(Bax,cleaved caspase-3,caspase-8,cleaved caspase-9,leaved PARP 及 cyt-c)表达增加,抗凋亡蛋白Bcl-2表达下降(P<0.05);FLDK治疗组较OGD/R组细胞凋亡率下降,促凋亡蛋白表达减少,抗凋亡蛋白表达增加(<0.05),表明,FLDK可抑制OGD/R损伤介导的HT22细胞凋亡。5 FLDK对OGD/R损伤后HT22细胞PI3K/Akt/GSK-3β信号通路的影响OGD/R损伤可导致HT22细胞Akt及GSK-3β磷酸化水平下降(P<0.05);与OGD/R组相比,FLDK治疗可提高细胞Akt及GSK-3β的磷酸化水平(P<0.05);为了验证FLDK对GSK-3β磷酸化水平的影响是否是通过激活PI3K/Akt实现的,在FLDK治疗前先给予LY294002(PI3K特异性抑制剂)进行预处理,结果显示LY294002可阻断上述FLDK对Akt及GSK-3β的磷酸化水平的提高作用(P<0.05),提示,PI3K是激活Akt/GSK-3β通路的一个上游主要调节酶,且FLDK对OGD/R损伤后HT22细胞的PI3K/Akt/GSK-3β信号通路具有激活作用。6 FLDK是通过激活PI3K/Akt/GSK-3β信号通路发挥抗氧化应激作用的结果3已表明,FLDK可抑制OGD/R损伤介导的细胞氧化应激。为了验证FLDK的抗氧化应激效应是否是通过激活PI3K/Akt/GSK-3β实现的,在FLDK治疗前先给予TDZD-8(GSK-3β特异性抑制剂)进行预处理,结果显示,TDZD-8可部分阻断上述FLDK对ROS和MDA含量增加以及SOD和GSH-Px活性下降的抑制作用,可降低FLDK对Nrf2核易位及HO-1蛋白表达的促进作用(P<0.05),提示,FLDK可能主要是通过激活PI3K/Akt/GSK-3β信号通路进而增加Nrf2核易位及HO-1蛋白表达,最终抑制OGD/R损伤介导的HT22细胞氧化应激。7 FLDK是通过激活PI3K/Akt/GSK-3β信号通路发挥抗凋亡作用的结果4已表明,FLDK可抑制OGD/R损伤介导的细胞凋亡。为了验证FLDK的抗凋亡作用是否是通过激活PI3K/Akt/GSK-3β实现的,在FLDK治疗前先给予TDZD-8进行预处理,结果显示,TDZD-8可部分阻断上述FLDK对细胞凋亡率和促凋亡蛋白表达的抑制作用(P<0.05),提示,FLDK可能主要是通过激活PI3K/Akt/GSK-3β信号通路抑制OGD/R损伤介导的HT22细胞凋亡。结论柿叶黄酮提取物可通过抑制OGD/R损伤介导的HT22细胞氧化应激和细胞凋亡发挥神经保护作用。其可能的分子生物学机制是:主要通过激活PI3K/Akt/GSK-3β信号通路,进而增加Nrf2核易位和下游抗氧化蛋白HO-1表达以及抑制促凋亡蛋白表达,最终发挥抗氧化应激和抗凋亡的神经保护效应。