第—部分 中缅边境恶性疟原虫DHPS.DHFR.PFMRPl基因多态性研究目的：通过基因扩增技术,研究中缅边境恶性疟流行地区恶性疟原虫磺胺多辛抗性相关基因二氢蝶酸合成酶DHPS基因,乙胺嘧啶抗性相关基因二氢叶酸还原酶DHFR基因以及多药物抗性相关蛋白PFMRP1基因,比较2008年与2012年单一感染病人株的抗药性基因点突变、多重突变的差异。方法：提取上述样本的DNA,应用巢式PCR(Nest-PCR)方法分别扩增单一感染株PFMRP1基因全长5469bp片段,DHPS基因包括436,437位密码子的长为319bp片段以及540、581、613位密码子在内的长为472bp片段,DHFR基因包括16、51、59、108、164位密码子在内的长度为646bp片段,并进行测序,再与标准株3D7的序列进行比对,得出基因突变结果,对结果进行统计学分析。结果：1.DHPS基因扩增,28株病人株中,获得319bp和472bp的片段,在已经报道的436、437、540、581四个位点中,均发现点突变,突变型为S436A、A437G.K540E/N.A581G.突变率分别为：46.43％、100%、71.43%、50%。2008年突变率分别为60％、100％、80％、33.33%,2012年突变率分别为30.77%、100%、61.54%、69.23%。2.DHFR基因扩增,28株病人株中,获得646bp的片段,在已经报道的51、59、108、164四个位点中,均发现点突变,突变型为N51I、C59R、S108N、I164L。突变率分别为：64.29％、100%、100％、71.43%。2008年突变率分别为53.33％、100％、100％、80.33％；2012年突变率分别为76.92％、100％、100%、61.54%。3.PFMRP1基因扩增,28株病人株中,获得此基因的全长5469bp片段,在已经报道的191、325、437、785、876、1007、1390七个位点中,均发现点突变,突变型为H191Y、N325S、S437A、H785N、1876V、T1007M、F1390I。突变率分别为：75％、10.71％、64.29％、25％、57.14％、35.71％、14.29％。2008年突变率分别为66.67%、6.67％、60％、13.33％、60％、26.67%、20%；2012年突变率分别为84.62％、15.38％、69.23％、38.46％、53.85％、47.15％、7.69%。结论：中缅边境2008年与2012年病人株的DHPS、DHFR、PFMRP1基因各位点的突变率进行比较,P值均大于0.05,都没有显著性差异。第二部分中缅边境恶性疟原虫对乙胺嘧啶等五种抗疟药抗药性的体外测定及与DHFR基因抗药性的关联分析研究目的：研究2008年与2012年中缅边境恶性疟原虫单一感染病人株,进行甲氟喹、哌喹、氯喹、乙胺嘧啶、苯芴醇5个药物敏感性的测定,分析不同年份病人株对不同药物敏感性差异；并通过基因扩增技术,研究其与乙胺嘧啶抗药性相关基因DHFR基因点突变情况,比较基因点突变与抗药性的关联。方法：1、对中缅边境恶性疟原虫2008年份15株、2012年份13株共28株病人株,同步化后进行甲氟喹、哌喹、氯喹、乙胺嘧啶、苯芴醇5个药物的抗药性测定。2、应用Nest.PCR扩增DHFR基因上的片段进行测序,与标准株3D7的序列进行比对,得出基因突变结果,再与抗药性进行关联分析。结果：1、2008年中缅边境恶性疟原虫病人株15株对甲氟喹、哌喹、氯喹、乙胺嘧啶、苯芴醇5种药物ICso值测定分别为：56.87±29.79nM、13.85±8.901nM、1265 ±845.2nM、3055±2178nM、4.669±2.147nM:2012年中缅边境恶性疟原虫病人株13株对氟喹、哌喹、氯喹、乙胺嘧啶、苯芴醇5种药物ICs0值测定分别为：58.09±20.40nM、17.13±8.893nM、808.1±481.5 nM、2079±943.2nM、4.906±2.430mM。2、对中缅边境恶性疟原虫2008年与2012年病人株的五种抗疟药物IC50值进行比较,P值均大于0.05,差异无统计学意义,则认为2008年与2012年病人株对这五种抗疟药物抗药性无显著性差异。3.DHFR基因突变位点突变率最高的为59、108位点,均为100%突变；统计分析发现,在位点51发生突变病人株与未发生突变病人株的乙胺嘧啶IC50比较,P=0.0440<0.05,两组间的差异有统计学意义。4、28株的病人株中,DHFR基因的二重突变C59R、S108N有2株,其乙胺嘧啶IC50的均数为1743nM,三重突变N51I、C59R、S108N有6株,其乙胺嘧啶IC50的均数为2679nM,三重突变C59R、S108N、1164L有8株,其乙胺嘧啶IC50的均数为1926nM,四重突变N51I、C59R、S108N、I164L有12株,其乙胺嘧啶IC50的均数为3127nnM,发现四重突变组的乙胺嘧啶IC50值最高,二重突变组的乙胺嘧啶IC50值最低,但比较多重突变组之间的乙胺嘧啶IC50值,P=0.1819>0.05,无统计学意义。结论：1、本实验的28株病人株中,甲氟喹敏感株6/28株,敏感性下降3.57%,表明该地区对甲氟喹仍具敏感性；哌喹敏感株4/28株,敏感性下降21.43%,表明该地区对哌喹产生了一定的抗性；氯喹全部为高抗性病人株,敏感性下降100%,表明该地区的恶性疟原虫对氯喹存在广泛严重的抗药性；乙胺嘧啶敏感株2/28株,敏感性下降71.43%,表明该地区对乙胺嘧啶已产生了相当严重的抗性；苯芴醇敏感株7/28株,敏感性下降42.86%,表明该地区对苯芴醇产生了比较严重的抗性。2、中缅边境2008年与2012年病人株的五种抗疟药抗药性无差异。3、DHFR基因51位点的突变与乙胺嘧啶抗药性有相关关系。4、经统计分析,不能认为DHFR基因多重突变与乙胺嘧啶抗药性有相关关系,但是发生突变的病人株对乙胺嘧啶IC50值大于该位点没有发生突变的病人株。第三部分高浓度药物持续给药筛选试验目的：研究中缅边境恶性疟原虫单一感染病人株对甲氟喹、青蒿琥酯、哌喹和双氢青蒿素四个药物持续加压给药,筛选出高抗株,并测定出高抗株在不同药物浓度时期的IC50值,得出病人株在不同药物浓度时期抗药性的关系,比较此方法得出的数据,推断青蒿素类药物与长效药物产生抗性是否相同。方法：对中缅边境恶性疟原虫鉴定出的单一感染株25株,即在前期工作中发现IC50值高于敏感标准株3倍以上的病人株,给予四个药物：甲氟喹、青蒿琥酯、哌喹和双氢青蒿素。使用已有ICso的2倍甚至是更高浓度药物,进行病人株体外培养,持续给药,诱导病人株,达到某一个最高抗性药物浓度作为结果,筛选出高浓度药物下成活的病人株为目的病人株,进行不同药物浓度的抗药性测定。结果：1、中缅边境恶性疟原虫病人株25株,共筛选出药物AS病人株1株：F08B32,分别选取3个浓度为30nm,60nm,90nm进行抗药性研究；DHA病人株2株：F08B41、F08B62,分别选取3个浓度为10nm,20nm,40nm进行抗药性研究；MQ病人株1株：F09N64,分别复苏浓度为0nm,70nm进行抗药性研究,其中70nnm再复苏未成活。2、对筛选出的病人株进行抗药性测定,F08B32株的AS30nm,60nm,90nm三个浓度ICso分别为22.690±2.325nm、39.170±2.461nm、56.500±9.856nm:F08B41株的DHA10nm,20nm,40nm三个浓度IC50分别为5.462±0.666nm、8.304±0.225nm、14.540±1.954nm:F08B62株的DHA10nm,20nm,40nm三个浓度ICso分别为2.826±0.055nm、4.118±0.113nm、8.140±0.072nm、3、筛选所得病人株的每个药物浓度进行比较,F08B32病人株的AS30nm/60nm/90nm组P=0.0014<0.05,差异有统计学意义,认为病人株F08B32青蒿琥酯三个药物浓度,测得IC50值不同；F08B41病人株的DHA10nm/20nm/40nm组P=0.0002<0.05,差异有统计学意义,认为病人株F08B41双氢青蒿素三个药物浓度,测得ICso值不同；F08B62病人株的DHA10nm/20nm/40mn组P<0.0001,差异有统计学意义,认为病人株F08B62双氢青蒿素三个药物浓度,测得ICso值不同；且由上可看出ICso值增加随着药物浓度的递增而增加。结论：恶性疟原虫对双氢青蒿素及青蒿琥酯两个药物的抗药性随药物浓度的递增而变大。