论文部分内容阅读
Calcimycin (A23187)是重要的聚醚类抗生素,不仅具有抗革兰氏阳性菌的作用,还是哺乳动物细胞的氧化磷酸化的解偶联剂和ATP酶的抑制剂,甚至引起细胞凋亡。Calcimycin (A23187)可特异地结合二价金属阳离子(钙离子、镁离子等),常用于钙离子穿膜时细胞膜生理属性的研究中。Calcimycin (A23187)的化学结构包含3个部分:α-酮吡咯环、螺旋环和氨甲基取代的苯并噁唑环。同位素喂养实验表明吡咯环来源于脯氨酸,螺旋环来源于2分子的乙酸和4分子的丙酸,苯并噁唑环来源于分支酸途径的3-羟基邻氨基苯甲酸,N-甲基来源于甲硫氨酸。鉴于calcimycin (A23187)独特的化学结构与作用机理,科学家们长期以来对其表现出浓厚的兴趣,自从1972年发现以来,16,000多篇文献报道了calcimycin (A23187)的相关研究,但是其生物合成机理一直悬而未决。本研究旨在分子水平上阐述calcimycin (A23187)的生物合成机理,从而为利用组合生物学手段开发新的药物奠定基础。根据脯氨酸腺苷转移酶的保守氨基酸区域设计兼并引物,通过PCR的方法克隆到了脯氨酸腺苷转移酶基因,进而从教酒链霉菌(Streptomyces chartreusis)NRRL 3882的基因组文库中克隆到了calcimycin (A23187)的生物合成基因簇,并从中挑选p14F11、p16F9和p6F5三个相互重叠的阳性科斯质粒拿去测序。生物信息学显示测定的101 kb的区域含有56个开放阅读框(open reading frame, ORF),其中的27个ORFs(64 kb)负责calcimycin (A23187)的生物合成。这27个orfs包含: 3个orfs (calN1-N3)负责吡咯环的合成,5个orfs (calA1-A5)编码I型聚酮合酶负责螺旋环的合成,4个orfs (calB1-B4)负责3-羟基邻氨基苯甲酸的合成,1个N-甲基转移酶基因(calM),1个抗性基因(calT),1个II型硫酯酶(calG), 3个调节基因(calR1-R3), 4个其它基因(calCDFH)和5个未知基因(calU1-U5)。通过同框缺失目标基因,确定了4个基因(calN1、calN2、calB2和calM)跟calcimycin (A23187)的生物合成直接相关,并体外酶活实验证实了CalM催化A23187的最后一步N-转甲基反应。以此为基础结合生物信息学分析和早期的同位素喂养结果成功推测出了calcimycin (A23187)的整个生物合成途径。CalN1是辅氨酰基脱氢酶,催化辅氨酰的脱氢反应,生成吡咯环。CalN2是脯氨酸腺苷转移酶,特异识别并活化脯氨酸。CalB2是异分支酸酶,催化2-氨基-2-脱氧异分支酸(ADIC)生成2,3-二氢-3-羟基邻氨基苯甲酸(DHHA)。CalM是N-甲基转移酶,催化calcimycin (A23187)生物合成的最后一步,使中间产物N-demethyl calcimycin (A23187)生成calcimycin (A23187)。体内中断实验证明,calN1N2B2M与calcimycin (A23187)的生物合成直接相关,calN1、calN2、calB2分别同框缺失的突变株都不仅失去了生产calcimycin (A23187)的能力,同时还失去了生产cezomycin和N-demethyl calcimycin (A23187)这2种中间产物的能力;calM同框缺失的突变株失去了生产calcimycin (A23187)的能力,但是仍然积累了大量的cezomycin和N-demethyl calcimycin (A23187)这2种中间产物;calN2、calM的各自回补菌株都恢复了生产这3种抗生素的能力;CalM的体外酶活实验证明,在S-腺苷甲硫氨酸(SAM)存在下,CalM催化中间产物N-demethyl calcimycin (A23187)生成calcimycin (A23187),这一结果与体内实验一致。Calcimycin (A23187)的生物合成起始于脯氨酸,经过腺苷化、脱氢等步骤生成吡咯环,接着以吡咯环为起始单元,利用2分子的丙二酰辅酶A和4分子的甲基丙二酰辅酶A作为延伸单元,经过6轮脱缩缩合合成成熟聚酮链,然后CalG(II型硫酯酶,thioesterase, TE)释放线性聚酮链或者聚酮链直接与3-羟基邻氨基苯甲酸缩合生成苯丙噁唑环,接着C3位羟基化、氨基化和N-甲基化,最后生成calcimycin (A23187)。