研究背景:Rheb是mTOR信号通路上游重要的调控蛋白。mTORCl药理学抑制剂雷帕霉素能够直接结合mTOR并抑制其活性。GDP结合状态的Rheb与雷帕霉素起到相同的抑制mTOR信号通路活性的作用。临床研究发现,用雷帕霉素作为器官移植免疫抑制剂会导致男性患者不育,该结果提示Rheb所在的mTOR信号通路在雄性生殖过程中是不可或缺的。目前已有研究表明Rheb在雄性生精细胞中的作用,但对其在睾丸支持细胞中的调控作用仍然了解很少,需要进一步的研究。研究目的:探究睾丸支持细胞中的Rheb基因在睾丸发育和精子发生过程中的作用及其相关的分子机制。研究方法:1.利用Amh-cre小鼠(睾丸支持细胞中特异表达cre酶的工具鼠)及RhebL/L小鼠组织特异性敲除睾丸支持细胞中的Rheb基因,采用普通PCR、real time-PCR、Western blot等方法鉴定敲除效果。2.采用病理学分析、精子活力测定以及计数等方法研究Rheb基因缺失对小鼠睾丸的发育、精子生成过程、精子动力学以及生育能力的影响。3.在Rheb敲除的基础上通过腹腔注射白消安构建生精损伤模型,研究病理状态下Rheb基因对小鼠睾丸的发育、精子生成过程、精子动力学以及生育能力的影响。4.采用流式细胞术、western blot和免疫组化的方法,检测睾丸组织中各级生精细胞比例的变化以及睾丸细胞的凋亡和增殖情况,探究睾丸支持细胞中Rheb基因调控的关键生精细胞类型。5.通过RNA-seq及Real-time PCR等方法研究Rheb基因敲除后睾丸内相关信号通路的变化及相关的分子机制。研究结果:一、睾丸支持细胞中Rheb基因敲除的鉴定通过RhebL/L和Amh-cre小鼠杂交得到支持细胞Rheb基因特异敲除的小鼠Amh-cre;RhebL/L。分别从DNA、RNA、蛋白水平对敲除效果进行了鉴定,结果表明,特异性敲除是发生在小鼠的睾丸组织中,证明模型构建成功。二、Rheb敲除对睾丸发育和精子发生过程的影响(1).Rheb敲除小鼠睾丸发育异常,体积和重量明显变小,约为对照组的50%。成年小鼠的附睾的重量也显著小于对照组。1月龄小鼠的生精小管中出现大量多核巨细胞。(2).精子计数和精子活力检测发现,Rheb敲除小鼠附睾尾中的精子数量发生显著性下降,约为对照组的50%,但精子活力并没有发生明显的变化。(3)HE染色结果表明Rheb敲除小鼠的精子异形性明显增加,睾丸组织的超微结构显示精子头部发生异形。但小鼠生育率没有受到明显影响,成年2到9月龄小鼠产仔数与对照组相当。三、病理状态下,Rheb敲除小鼠的生育力下降通过腹腔注射白消安构建了小鼠生精损伤模型,结果表明病理状态下Rheb敲除小鼠的精子数量和活力都有显著性下降,并导致小鼠不育,而对照组小鼠的精子数量虽有降低,但仍能正常生育。四、支持细胞中Rheb影响睾丸发育和精子发生的相关机制。(1).Rheb敲除小鼠的睾丸曲细精管数量和面积减小导致小鼠睾丸变小。(2).通过流式细胞术检测以及Sycp3特异性标记精母细胞发现,Rheb敲除小鼠的精母细胞的数量明显减少。(3).TUNEL和Ki67染色结果显示,睾丸组织中精母细胞凋亡增加,细胞增殖无明显差异。(4).通过RNA-seq和Real-time PCR的方法检测了睾丸中差异表达的基因,发现支持细胞特异表达调控睾丸内的铁平衡的Tf基因以及凋亡相关因子IGFBP3的表达明显增加。结论:睾丸支持细胞中的Rheb基因在睾丸发育和精子发生过程中发挥着重要的作用,支持细胞中Rheb特异性缺失会导致生精细胞减数分裂过程异常,精母细胞凋亡增加。这个过程至少部分是通过影响Tf调控通路来起作用的。