传染性支气管炎（Infectious Bronchitis，IB）是由传染性支气管炎病毒（Infectious Bronchitis Virus，IBV）引起的急性高度接触性传染病。是当今危害养禽业最严重的疫病之一。 IB的控制主要依赖IBV弱毒疫苗的预防接种。使用活疫苗存在外源性或垂直传播性病原污染、毒力返祖等缺陷，开发安全、有效的新型疫苗是IB控制的研究重点。近年来，用转基因植物表达抗原相对传统的疫苗生产方式来说是更经济、有效和具有发展潜力的生产系统。已经有多种抗原基因在转基因植物中表达，并且植物中表达的抗原保持良好的免疫原性，并可刺激体液和粘膜免疫。本研究在克隆和分析IBV S1遗传变异规律的基础上，构建了IBV-H52 S基因的植物表达载体，并成功转化马铃薯植物，在抗性筛选的基础上进行分子生物学鉴定，最后对植物来源的疫苗免疫动物，进行免疫原性的研究。具体结果如下： 1．参照已报道的IBV-Beaudette株S1基因核苷酸序列，设计并合成一对特异性寡聚核苷酸引物，用TRIzol试剂抽提的IBV-Sc021202毒株的病毒RNA作为反转录聚合酶链反应（RT-PCR）的模板，扩增得到长度约1.9kb的S1基因，并经测序分析。结果显示：Sc021202毒株S1基因全长为1923bp，编码S1蛋白前体，共618AA，其中，1-18个为信号肽（在真核细胞中将被切除）；19-618个为S1亚单位，共600个AA。 对获得的肾型毒株IBV-Sc021202的S1基因核苷酸及推导的氨基酸序列与GenBank中31个IBV毒株的相应序列用DNAstar、OMIGA等分析软件进行同源性比较和分析，结果表明，IBV-Sc021202毒株存在高度变异和相对保守区，含有插入和缺失突变，其中281、285和465位的氨基酸是独特的变异位点，其核苷酸与已报道的肾型毒株IBV-X、J的同源性较高，分别为94.4％和86.2％，氨基酸的同源性为94.5％和87.7％；而与肾型Holte、Gray等的核苷酸与预测氨基酸的的同源性较低，核苷酸为75.1％和72.5％，氨基酸的同源性在73.8％和73.10％；与其它毒株的核苷酸与预测的氨基酸序列的同源性在72.6-80.8％和73.1-81.8％之间。 2．用RT-PCR扩增IBV-H52S基因序列并测序分析，再利用重新设计的含XbaⅠ和BamⅢ酶切位点的引物，将获得的PCR产物定向插入植物表达载体pBI121 35S启动子下游，用三亲交配法将重组克隆导入根癌农杆菌EHA105，PCR及酶切鉴定，证实获得了含pBI121-IBVS质粒的农杆菌菌株。 3．通过农杆菌介导的遗传转化方法转化马铃薯茎段，在抗性筛选培养基上筛选，共获51株抗卡那霉素的再生植株。对所获得51个转基因马铃薯株系进行PCR检测，48株能够扩增出目的基因。 4．选取PCR鉴定为阳性的6个植株，用单一限制性内切酶酶切其基因组DNA，并进行Southern印迹杂交实验，结果表明，目的基因已经整合到马铃薯染色体上，整合的拷贝数 浙江大学博士论文 为卜，大多为2拷贝。 5．对5株马铃纫’山N。，比e，n1。kt纠果，多数转杜回植株，，1。夕「源某囚能丁常转录，＊’ IVJ外源插入丛囚在RNA水个上得到了表达，转录水下有差异。 6．对N；；，讨；。，；；H川为m件的枪川【11捉蛋门进行SDS十MIZ电泳和伽s比r；。印)业杂灭纠 果表叫，切义个M川山泳介转从卜＋，’帆w。J状测到竹殊的蛋肉条卅，们进 步的WCs比；T；「DI 迹杂交却未见I刊O蛋＊杂交条卅，排测。。｝能为及达员不够高。