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microRNA-455-5p(miR-455-5p)是一个广泛保守的miRNA家族成员,在大多数动植物中均有表达。在小鼠中,miR-455-5p位于4号染色体的4 B3;4位点,由Col27a1(collagen type XXVII alpha 1 chain)基因编码。有研究报道miR-455-5p与子痫前期、阿尔茨海默症、多发性硬化症及癌症等人类疾病有关。此外,miR-455-5p还参与软骨发育及脂肪生成。然而,目前关于miR-455-5p在骨骼肌中的功能所知甚少。本研究以C2C12细胞为模型来探究miR-455-5p在骨骼肌细胞增殖和成肌分化中的功能。在第一部分研究中,我们首先探究了miR-455-5p在C2C12细胞增殖过程中的功能;其次优化了C2C12细胞成肌分化的条件,获得较为成熟的C2C12成肌分化条件;最后探究了miR-455-5p在C2C12细胞成肌分化过程中的功能。首先,分别转染miR-455-5p mimics及miR-455-5p inhibitor到C2C12细胞,利用CCK8、EDU及细胞周期实验检测C2C12细胞的增殖及凋亡情况,结果显示过表达和抑制miR-455-5p均不影响C2C12细胞的增殖及凋亡。随后,我们将C2C12细胞分别以3.75×10~4、5.00×10~4及7.00×10~4的数目接种到24孔板,在培养液中分别加入2%、5%及10%的马血清进行成肌分化诱导,结果表明,当接种的细胞个数为5.00×10~4组合2%马血清诱导时可获得最佳成肌分化结果。进一步,我们利用miR-455-5p mimics及miR-455-5p inhibitor对miR-455-5p分别进行过表达及抑制,并对诱导成肌分化2天、4天、6天及8天的肌管进行了免疫荧光染色,并对肌管长度、直径及融合率进行统计。结果表明,在成肌分化2天时,miR-455-5p的过表达及抑制不影响成肌分化结果;在成肌分化4天时,miR-455-5p过表达会促进肌管分化,miR-455-5p抑制则会导致肌管分化失败,形成短小肌管;在成肌分化6天及8天时,miR-455-5p过表达会促进肌管长度、直径、融合率及肌肉特异性基因的表达显著升高,而miR-455-5p的抑制则会导致肌管长度、直径、融合率及肌肉特异性基因的表达显著下降。综上所述,miR-455-5p过表达及抑制不影响C2C12细胞的增殖及凋亡。miR-455-5p过表达促进C2C12成肌分化,甚至造成肌管肥大,miR-455-5p抑制导致C2C12成肌分化失败。在第二部分研究中,为了进一步探究miR-455-5p调控C2C12细胞成肌分化的分子机制,我们利用双荧光素酶实验找到了miR-455-5p的靶基因Mylip,并对其进行了验证,随后对Mylip在C2C12细胞成肌分化中的功能进行了深入探究。最后,我们利用功能恢复实验,进一步验证了miR-455-5p对Mylip的调控作用。我们首先通过靶基因预测网站找到了潜在的靶基因Mylip、Add3、Taf4a、Luc7l3、Brd1、Gdap2、Dcaf5及Irf2,并构建双荧光素酶载体进行了双荧光素酶实验,结果表明Mylip为miR-455-5p的靶基因。为了进一步验证上述结果,我们对miR-455-5p进行过表达或抑制,检测肌管分化2、4、6及8天Mylip的变化。RT-qPCR及免疫印迹结果表明,当miR-455-5p过表达时,Mylip转录及蛋白水平显著下降,当miR-455-5p被抑制时,Mylip转录水平显著升高,进一步证明Mylip为miR-455-5p的靶基因。随后,我们对Mylip在C2C12细胞成肌分化过程中的功能进行了探究。分别敲减以及过表达Mylip,观察成肌分化2天、4天、6天及8天的肌管,结果表明,在成肌分化2天时,Mylip的敲减及过表达不影响成肌分化;在成肌分化4天时,Mylip敲减会导致肌管长度增加,Mylip过表达则会导致肌管长度减小,Mylip敲减及过表达均不会影响肌管直径及融合率。在成肌分化6天及8天时,Mylip敲减会促进肌管长度、融合率及肌肉特异性基因的表达显著升高,而Mylip的过表达则会导致肌管长度、融合率及肌肉特异性基因的表达显著下降。为了进一步明确miR-455-5p对Mylip的调控关系,我们对miR-455-5p过表达的同时过表达Mylip,Mylip的过表达可部分或完全恢复由miR-455-5p过表达所造成的肌管肥大现象。综上所述,Mylip敲减会促进肌管分化,Mylip过表达则会抑制肌管分化。miR-455-5p通过调控Mylip的表达,进而调控肌管分化。在第三部分研究中,为了找到miR-455-5p及Mylip参与的信号通路,我们利用TMT标记定量蛋白组学技术对C2C12细胞过表达miR-455-5p且分化6天后的细胞样品进行了质谱分析,并对筛选到的潜在信号通路进行了验证。通过对质谱进行数据分析,我们共得到113个差异蛋白,其中51个上调蛋白,62个下调蛋白。为了找到miR-455-5p及Mylip可能参与的信号通路,我们进行了GO及KEGG分析,并且富集到了RhoA/ROCK信号通路。为了明确miR-455-5p及Mylip是否参与了RhoA/ROCK信号通路,我们首先对miR-455-5p进行过表达或抑制,检测RhoA/ROCK信号通路涉及的基因表达情况,结果表明,miR-455-5p过表达或抑制不影响RhoA及Rock的表达,但却会显著改变MLCP家族两个重要成员Ppp1r12b及Ppp1r12c表达。随后我们对Mylip进行敲减或过表达,进而检测RhoA/ROCK信号通路涉及基因的表达情况,有意思的是RhoA及Rock的表达没有显著变化,而Ppp1r12c表达显著改变。此外,Ppp1r12c的敲减会导致肌管分化失败。综上所述,miR-455-5p通过靶基因Mylip调控Ppp1r12c,进而调控C2C12细胞成肌分化过程。