目的：Rapamycin作为mTOR的抑制剂广泛应用移植物排斥反应。近年来，有研究表明rapamycin体外有抑制骨髓瘤细胞系增殖作用，体内应用于荷骨髓瘤小鼠模型使瘤体缩小。Rapamycin对MM细胞作用的机制尚未完全阐明。本研究将mTOR抑制剂rapamycin应用于人MM细胞系RPMI8226细胞，观察rapamycin对RPMI8226细胞增殖、凋亡的影响。有学者研究发现，cyclinD1在细胞增殖过程中起着重要的作用，在MM细胞呈高表达，与MM细胞的增殖相关，检测rapamycin作用前后MM细胞cyclinD1的表达情况，可以了解rapamycin抑制MM细胞增殖并诱导其凋亡是否与cyclinD1表达调控有关.CXCR4作为趋化因子受体在MM细胞归巢中起着重要的作用，通过CXCR4/SDF-1使MM细胞定位于骨髓。有研究表明CXCR4阳性的造血细胞可以使AKI、磷酸化，同时诱导分泌VEGF，进而促进肿瘤的发生。本研究通过检测rapamycin作用后CXCR4在RPMI8226细胞中mRNA以及蛋白水平的表达变化，进一步探讨rapamycin对骨髓瘤细胞作用的分子生物学机制，为本药临床应用奠定理论基础。 方法： 1.细胞培养和传代 人类MM细胞株RPMI8226的培养和传代人MM细胞株RPMI8226，培养于含20％灭活胎牛血清(FBS)、100U/ml的青霉素和100 μ g/ml硫酸链霉素的RPMI1640培养液中，置37℃、5％的二氧化碳的培养箱中培养，每5-6天传代1次，实验用对数生长期的细胞。 2.Rapamycin对RPMI8226细胞生长抑制的影响 2.1 MTT法检测rapamycin对RPMI8226细胞生长抑制的影响取对数生长期的RPMI8226细胞，调整细胞密度为2×105/ml，加入不同浓度的rapamycin分别作用24h、48h、72h，培养结束前4h加入20 μl MTT(5mg/ml)；离心培养板，小心吸去上清，加入DMSO 200 μl，振荡溶解formazon结晶，酶标仪490nm测A值，绘制细胞生长曲线。 2.2 Rapamycin对RPMI8226细期周期阻滞的影响应用流式细胞术检测。在细胞培养体系中加入不同浓度的rapamycin，培养48h后，收集细胞，4℃低速离心，PBS洗涤2遍。加入-20℃预冷的80％乙醇2ml混匀，4"C过夜。用PBS洗涤2次，10g/L的PI染液染色30min，上FACSCallibur流式仪检测，CellQuest软件进行细胞周期分析，计算各期细胞所占的比例。实验重复3遍。 2.3 Rapamycin对RPMI8226凋亡的影响采用倒置显微镜下原位形态学观察及FCM检测Sub-G1期细胞比例方法。 3.Rapamycin对人MM细胞株RPMI8226趋化因子受体CXCR4、cyclinD和mTOR表达的影响 3.1流式细胞术检测rapamycin对RPMI8226细胞表面趋化因子受体CXCR4表达率的影响取对数生长的RPMI8226细胞，调整细胞密度为2×105/ml，接种于24孔培养板，加入不同浓度rapamycin作用24h后，收集细胞，用冷PBS洗两遍后，各取细胞悬液100μl，分别加入CD184(CXCR4单抗)6μl，对照组加入CD46μl，轻轻混匀，室温避光反应30分钟，立即在流式细胞仪上检测，计数104细胞，以对照管作为阴性对照，CELLQuest软件分析，粘附分子CD184表达水平以阳性细胞百分数表示。 3.2 半定量逆转录-聚合酶链反应(semiquantitative reverse transcription polymerase chain reaction，RT-PCR)方法检测rapamycin不同浓度不同时间作用于RPMI8226细胞后CXCR4和cyclinD1 mRNA的表达，以β-actin为内对照，CXCR4及cyclinD1 mRNA/β-actin mRNA作为CXCR4及cyclinD1的相对表达丰度。 3.3 实时荧光定量PCR(RQ-PCR)方法检测rapamycin不同浓度作用于RPMI8226细胞后mTOR mRNA水平的表达，以β-actin为内对照，通过公式X0=2[Ct(β-actin)-Ct(mTOR)]，计算mTOR mRNA的表达量。 结果： 1.Rapamycin体外可影响人MM细胞株RPMI8226的增殖、凋亡及细胞周期进程 1.1 Rapamycin对细胞增殖的影响：Rapamycin抑制RPMI8226细胞增殖，并且呈现时间及剂量依赖性。72h的rapamycin的IC50值为20nmol/L。当rapamycin浓度为1nmol/L、5 nmol/L、10 nmol/L、20 nmol/L、50 nmol/L、100nmol/L、500 mnol/L时，24h的细胞增殖抑制率分别为5％、6％、11％、14％、16％、20％、29％；48h的细胞增殖抑制率分别为27％、32％、42％、46％、51％、58％、62％；72h的细胞增殖抑制率分别为32％、35％、45％、52％、58％、64％、71％。 1.2 Rapamycin作用后细胞形态学变化：相差显微镜观察20nmol/L的rapamycin作用24h、48h、72h后，RPMI8226细胞出现折光性减低，体积缩小，胞浆颗粒及空泡，胞核固缩及核碎裂，并且可见细胞碎片。对照组(不加rapamycin组)细胞则形态完整，核物质分布均匀，细胞无凋亡形态学改变。 1.3 Rapamycin对细胞周期进程的影响：Rapamycin浓度为0nmol/L、10 nmol/L、20 nmol/L、50 nmol/L、100 nmol/L、500 nmol/L时，作用于RPMI8226 48h后，应用流式细胞术检测用药前后细胞周期阻滞情况。结果显示：不同浓度的G0/G1期的细胞比例分别为：40.11％、51.24％、52.36％、60.01％、71.96％、73.25％，且亚G1(sub-G1)期细胞增加，提示随rapamycin浓度增加，G0/G1期细胞比例呈上升趋势，出现G0/G1期阻滞及细胞凋亡。 2.Rapamycin对RPMI8226细胞趋化因子受体CXCR4表达的影响：Rapamycin作用于RPMI8226细胞24h、48h、72h后，随着rapamycin浓度增加，RT-PCR和流式细胞术检测显示趋化因子受体CXCR4 mRNA和蛋白表达水平呈现出下降趋势，随时间延长无明显变化。 3.Rapamycin对RPMI8226细胞周期蛋白D1mRNA表达的影响：不同浓度rapamycin作用RPMI8226细胞24h后，应用RT-PCR检测显示随rapamycin浓度增加cyclin D1 mRNA表达水平下降。 4 Rapamycin对RPMI8226细胞mTOR mRNA表达的影响：不同浓度rapamycin作用RPMI8226细胞24h后，应用RQ-PCR检测显示随rapamycin浓度增加mTOR mRNA表达水平下降。 结论： 1.在一定浓度范围内，rapamycin以时间-剂量依赖方式抑制RPMI8226细胞的生长。 2.Rapamycin诱导RPMI8226细胞周期阻滞于G0/G1期及细胞凋亡，机制可能与cyclinD1mRNA表达下调有关。 3.Rapamycin在蛋白和mRNA水平下调RPMI8226细胞趋化因子受体CXCR4以及mTOR mRNA的表达。