近年来,在全世界范围内的心血管疾病患病率日益增加,并且成为仅次于恶性肿瘤的第二个致死原因。而心肌异常肥厚和心肌纤维化可引起多种不同程度的心脏损伤,至今临床上未获得治疗心肌肥厚和心肌纤维化相关疾病的满意方法,因此阐明心肌肥厚和心肌间质纤维化的发生和发展机制,对预防和逆转心肌肥厚和心肌间质纤维化,以及提高相关心血管疾病患者的治愈率有重要意义。组织激肽释放酶相关肽酶(tissue kallikrein-related peptidases,KLKs)属于丝氨酸蛋白酶家族。目前对于这一家族的亲本基因KLK1在心血管系统的生物学效应已有大量研究,KLK1可以使其底物激肽原水解生成缓激肽、赖氨酸缓激肽和甲胰缓激肽等激肽类物质,后者作用于缓激肽B1受体和B2受体,从而发挥促血管舒张和血管新生、抑制心肌细胞凋亡和心肌肥大以及抗心肌纤维化等心血管保护效应。然而,作为KLKs家族的新成员KLK8在心脏中的作用仍未完全阐明。本实验室前期已经发现KLK8过表达能够促进原代培养的心肌细胞肥大。因此,本论文的第一部首先采用心肌内注射KLK8腺病毒和构建KLK8转基因(Transgenic of KLK8,Tg-KLK8)大鼠的方法,在整体水平证实了心肌KLK8过表达确实可以导致大鼠发生心肌肥厚。在此基础上又进一步观察了EGF和PAR通路是否参与了KLK8促进心肌肥厚的作用机制。研究KLK8是否具有促进心肌肥厚的作用以及KLK8促进心肌肥厚的分子机制。心肌肥厚病理进展过程中通常伴有心肌纤维化这一心肌重构表型。我们在12周龄的KLK8转基因大鼠中也发现其心脏组织中胶原沉积显著增多,发生了显著的心肌间质纤维化改变,同时血清中内皮细胞损伤标志物含量显著增高。近年来有关心肌间质纤维化发生机制的重要研究进展之一就是发现心脏组织中通过内皮-间质转化(endothelial-mesenchymal transition,End MT)也会转化为成纤维细胞,从而导致组织纤维化的发生。而内皮细胞损伤则是End MT的关键触发因素之一,因此在第二部分的研究中,我们的主要目的是明确KLK8是否通过诱导End MT而促进心肌间质纤维化,并阐明其分子机制。主要实验内容与结果如下:第一部分KLK8促进心肌肥厚的作用及其分子机制成功构建大鼠左心前壁感染KLK8腺病毒模型,通过WGA染色方法发现注射Ad-KLK8的左心室前壁心肌细胞横截面积是注射Ad-vector组的约1.3倍。提示心脏局部KLK8过表达促进心肌细胞肥大的作用。一、心肌内注射KLK8腺病毒促进心肌细胞肥大二、KLK8转基因大鼠呈现显著的心肌肥厚(一)转基因过表达KLK8诱导心肌肥厚我们成功构建KLK8转基因大鼠(Tg-KLK8)全身KLK8过表达模型,取6周龄和12周龄大鼠心脏组织检测心肌细胞肥大标志物ANP、BNP和Myh7的m RNA表达的变化。结果显示与同龄野生型大鼠相比,KLK8转基因大鼠心肌组织中ANP、BNP和Myh7的m RNA表达量显著增加。WGA染色结果则表明与对照相比,6周龄和12周龄的KLK8转基因大鼠的心肌细胞横截面积显著增大。提示转基因过表达KLK8可以促使大鼠发生心肌肥厚。(二)转基因过表达KLK8对心脏功能的影响心脏超声心动图显示6周龄和12周龄KLK8转基因大鼠与同龄对照大鼠相比,其左心室室壁显著增厚、心室内径减小。血流动力学结果则表明6周龄KLK8转基因大鼠左心室内压最大上升速率(d P/dtmax)和左心室内压最大下降速率(d P/dtmin)显著增加,而12周龄KLK8转基因大鼠的d P/dtmax和d P/dtmin较对照显著降低。以上结果表明转基因过表达KLK8可以导致大鼠发生心肌肥厚和进展性的心功能障碍。三、KLK8促进心肌肥厚的作用机制(一)EGF信号转导通路参与KLK8诱导心肌细胞肥大的作用1.我们分离培养乳鼠原代心肌细胞感染KLK8腺病毒,然后采用EGFR拮抗剂AG1478处理或者小干扰RNA片段(si RNA)敲低EGF受体(EGF receptor,EGFR)表达。结果表明KLK8过表达显著增高心肌细胞肥大标志物BNP和Myh7的m RNA水平,而EGFR拮抗剂处理或si RNA敲低EGFR表达后均可显著减弱KLK8诱导的BNP和Myh7的m RNA表达。2.大鼠心肌内注射KLK8腺病毒,同时经腹腔注射EGFR拮抗剂AG1478(3mg/kg/天),两周后取大鼠心脏组织进行心肌肥厚标记物ANP、BNP和Myh7检测。结果显示KLK8过表达导致心肌内ANP、BNP和Myh7的m RNA水平显著增高,而EGFR拮抗剂AG1478则可显著抑制心肌内KLK8过表达诱导的ANP、BNP和Myh7的m RNA表达。WGA染色结果则表明感染KLK8腺病毒的大鼠心肌细胞横截面积显著增大,而EGFR拮抗剂则可逆转心肌内KLK8过表达诱导的心肌细胞肥大。上述细胞和整体水平的结果均表明,EGFR信号通路参与了KLK8诱导心肌细胞肥大的病理发生过程。(二)PAR1和PAR2参与KLK8诱导心肌肥厚的作用我们首先将原代培养的心肌细胞感染KLK8腺病毒使KLK8过表达,然后采用si RNA技术敲低PAR1或PAR2表达,或采用PAR1拮抗剂RWJ56110或PAR2拮抗剂FSLLRY-NH2处理细胞。结果显示KLK8过表达显著增高心肌细胞肥大标志物ANP、BNP和Myh7的m RNA水平,而PAR1/PAR2拮抗剂、敲低PAR1/PAR2表达均可显著减弱KLK8诱导的ANP、BNP和Myh7的m RNA水平。我们采用心肌内注射KLK8腺病毒使KLK8过表达,同时经腹腔注射PAR1拮抗剂RWJ56110(1mg/kg/天)或PAR2拮抗剂FSLLRY-NH 2(1mg/kg/天),两周后取大鼠心脏组织检测心肌肥厚标志物ANP、BNP和Myh7的m RNA水平。结果显示KLK8过表达导致心肌内ANP、BNP和Myh7的m RNA水平显著增高,而PAR1或PAR2拮抗剂则可显著抑制KLK8过表达诱导的ANP、BNP和Myh7的m RNA表达。WGA染色结果则表明感染KLK8腺病毒的大鼠心肌细胞横截面积显著增大,而PAR1/PAR2拮抗剂处理则可逆转心肌内KLK8过表达诱导的心肌细胞肥大。上述细胞和整体水平的结果均表明PAR1或PAR2参与了KLK8诱导心肌细胞肥大的病理发生过程。(三)KLK8通过EGFR和PAR介导而激活ERK1/2和NFκB信号通路我们采用心肌内注射KLK8腺病毒使KLK8过表达,同时经腹腔注射EGFR拮抗剂AG1478(3mg/kg/天)、PAR1拮抗剂RWJ56110(1mg/kg/天)或PAR2拮抗剂FSLLRY-NH 2(1mg/kg/天),两周后取大鼠心脏组织进行检测。结果表明,心肌内过表达KLK8导致ERK1/2和NFκBp65亚基磷酸化水平显著升高,而EGFR拮抗剂、PAR1或PAR2拮抗剂则可逆转KLK8过表达诱导的ERK1/2、NFκB活化。提示KLK8可能通过EGFR和PAR介导而激活ERK1/2和NFκB信号通路。第二部分KLK8促进心肌间质纤维化的作用及其分子机制一、KLK8转基因大鼠呈现显著的心肌间质纤维化Masson染色结果显示与同龄野生型大鼠相比,6周龄KLK8转基因大鼠心肌组织中未见明显的胶原纤维沉积,而12周龄的KLK8转基因大鼠心肌组织间质区域出现显著胶原纤维沉积。此外,12周龄KLK8转基因大鼠心肌组织中I型胶原、羟脯氨酸和TGF-β含量较之同龄野生型大鼠显著增加。以上结果说明转基因过表达KLK8可以促使大鼠发生心肌间质纤维化。二、转基因过表达KLK8促使内皮细胞损伤和内皮间质转化(一)转基因过表达KLK8诱导内皮细胞损伤与同龄正常野生型大鼠相比,6周龄KLK8转基因大鼠血清中E-Selectin的含量明显升高,但是TM和VWF含量未见显著升高。而12周龄时KLK8转基因大鼠与对照相比,其血清中内皮细胞损伤标记物E-Selectin、TM和VWF三者均有显著升高。提示转基因过表达KLK8可导致内皮细胞损伤。(二)转基因过表达KLK8促使心肌组织发生End MT Western Blot结果表明,与正常野生型大鼠相比,KLK8转基因大鼠心脏组织中间质细胞标志物波形蛋白(vimentin)和平滑肌激动蛋白(α-SMA)表达显著升高,而内皮细胞标志物血管内皮钙黏蛋白(VE-cadherin)和CD31蛋白表达水平则明显降低。免疫荧光双标染色和共聚焦观察结果表明,与正常野生型大鼠相比,KLK8转基因大鼠心肌组织中内皮细胞标志物CD31的表达有明显的降低,而间质细胞标志物vimentin和FSP-1表达显著增多,并且CD31/vimentin和CD31/FSP-1共染的阳性细胞显著增多。此外,我们通过共聚焦Z-stack分析Z轴方向的免疫荧光染色,发现CD31/vimentin和CD31/FSP-1在KLK8转基因大鼠心肌组织中确实存在共定位。上述结果表明转基因过表达KLK8促使心肌组织发生End MT。三、KLK8过表达促使人冠状动脉内皮细胞损伤和内皮间质转化(一)KLK8过表达诱导人冠状动脉内皮细胞损伤KLK8腺病毒感染人冠状动脉内皮细胞后,MTT法检测感染腺病毒1天、3天和5天时内皮细胞活力和细胞培养上清中内皮损伤标志物含量。结果表明,KLK8过表达可以剂量依赖性地抑制内皮细胞活力,同时导致细胞培养上清中内皮细胞损伤标志物E-Selectin、TM和VWF含量显著增加。说明KLK8过表达可以导致人冠状动脉内皮细胞损伤。(二)KLK8过表达促使人冠状动脉内皮细胞发生End MT Western Blot结果表明与感染对照腺病毒相比,感染KLK8腺病毒的HCAEC中间质细胞标志vimentin和α-SMA表达显著升高,而内皮细胞标志物VE-cadherin和CD31蛋白表达水平则明显降低。免疫荧光双标染色结果可见感染KLK8腺病毒后,内皮细胞标志物CD31表达明显减少,而α-SMA、vimentin和FSP-1阳性细胞数量显著增多。以上结果表明KLK8过表达促使人冠状动脉内皮细胞发生End MT。四、KLK8过表达诱导End MT的分子机制(一)筛选心脏组织中与KLK8相互作用的潜在靶蛋白结合免疫沉淀(IP)和高通量的蛋白质组学研究方法,我们在KLK8转基因大鼠心肌组织样本中,筛选可能与KLK8相互作用的潜在靶蛋白。质谱分析结果显示有若干个已知在细胞间桥粒连接、粘附连接和紧密连接结构中起关键作用的蛋白分子可能与KLK8相互作用。其中桥粒斑珠蛋白(plakoglobin,又称γ-catenin)在内皮细胞中是与VE-cadherin共同构成黏附连接的重要蛋白。(二)KLK8可能通过作用于VE-cadherin继而促γ-catenin发生核转位1.KLK8、γ-catenin和VE-cadherin三者在心脏组织中存在相互作用通过免疫共沉淀方法发现在KLK8转基因大鼠心脏组织中KLK8、γ-catenin和VE-cadherin三者存在相互作用。2.人冠状动脉内皮细胞中KLK8过表达促进γ-catenin发生核转位免疫荧光染色结果发现γ-catenin在感染对照腺病毒的HCAEC中主要表达于胞浆,而在感染KLK8腺病毒的HCAEC中,细胞核内γ-catenin表达显著增多。提示KLK8可以促使γ-catenin发生核转位。(三)KLK8过表达促使内皮细胞中p53表达增多和核转位免疫荧光双标染色和共聚焦结果可见与正常野生型大鼠相比,KLK8转基因大鼠心肌组织中内皮细胞标志物CD31的表达有明显的降低,而p53表达显著增多,同时CD31/p53共染的阳性细胞显著增多。此外,我们通过共聚焦Z-stack分析Z轴方向的免疫荧光染色,发现CD31/p53在KLK8转基因大鼠心肌组织中确实存在共定位。免疫荧光染色的结果发现p53在感染对照腺病毒的HCAEC中主要表达于胞浆,而在感染KLK8腺病毒的HCAEC中,细胞核内p53表达显著增多。提示人冠状动脉内皮细胞中KLK8过表达促进p53发生核转位。p53抑制剂Pifithrin-α可以逆转KLK8过表达诱导的HCAEC中VE-cadherin、CD31蛋白表达降低以及vimentin蛋白表达升高的现象。初步提示阻断p53信号通路可以逆转KLK8过表达诱导的人冠状动脉内皮细胞发生End MT。结论:1.转基因过表达KLK8导致心肌肥厚和进展性心功能障碍;KLK8可以通过EGFR和PAR介导而激活ERK1/2和NFκB信号通路,这可能是KLK8促进心肌肥厚的关键机制。2.转基因过表达KLK8促使大鼠心肌组织发生End MT和心肌间质纤维化;KLK8过表达诱导冠状动脉内皮细胞损伤和内皮间质转化的机制可能与其作用于VE-cadherin-γ-catenin复合物,继而促使γ-catenin发生核转位、激活下游p53信号通路有关。