家蚕作为鳞翅目模式昆虫和重要的经济昆虫,其基因组框架图及精细图的完成,加上本实验室拥有的600多个家蚕基因突变品系,为家蚕的功能基因研究提供了丰富资源。卵黄原蛋白受体(Vitellogenin receptor, VgR)是卵生动物的卵巢及胚胎发育的重要基因,它的主要功能是通过胞吞作用介导卵黄原蛋白(Vitellogenin, Vg)进入卵巢,为卵母细胞发育提供营养。目前为止,已经报道了11种昆虫VgR的cDNA及基因组序列,它们都属于低密度脂蛋白受体,具有典型的LDLR保守功能结构域。昆虫卵黄原蛋白受体的表达分析显示,VgR在卵黄发生的整个时期都有表达,表达的组织限定在卵巢中。果蝇及鸡类的卵黄原蛋白受体的缺失突变体不能产卵：在美洲狗蜱、长角血蜱和火蚁中,应用dsRNA介导的干扰技术对VgR进行沉默,结果对卵巢的发育都造成了一定的影响,卵子不能形成或产生畸形卵,这些都表明VgR在卵巢发育过程中具有重要的作用。本实验室已报道了家蚕卵黄原蛋白受体基因(BmVgR)3’端的部分序列。本研究在现有的BmVgR基因序列和家蚕全基因组数据库的基础上,利用RT-PCR、基因克隆、原位杂交、Northern杂交等技术对BmVgR的全长cDNA进行了克隆及表达定位分析；并结合家蚕白妙卵(vit)突变体及RNAi技术对家蚕BmVgR的功能进行了初步探讨,主要研究结果如下：1.家蚕卵黄原蛋白受体的信息分析及全长克隆本实验在家蚕基因组数据库的基础上,对家蚕卵黄原蛋白受体的信息分析显示,BmVgR位于家蚕第20号染色体上的nscaf481上。通过片段克隆、测序、拼接,结果获得了BmVgR的cDNA全长序列5746bp(登录号为：HM172611)。该基因有35个外显子,基因组大于70kb.包含了完整的开放阅读框,信号肽的位置在氨基酸17.18aa之间,即在氨基酸结点CVG-QF处,信号肽包含17个氨基酸残基MKVVLLAIVLCTTSCVG。BmVgR编码的蛋白含1809个氨基酸残基,预测蛋白分子量为202.5kDa,等电点为5.54。氨基酸的多序列比对分析发现,BmVgR与其它昆虫物种的卵黄原蛋白受体一样,具有低密度脂蛋白受体家族的保守功能域；卵黄原蛋白受体的进化分析显示,它与传统的物种进化关系一致。2.家蚕卵黄原蛋白受体的转录特性及细胞定位通过RT-PCR方法对BmVgR的组织、时期表达进行检测,结果显示,BmVgR只特异的在卵巢组织中表达,在其它的组织如触角、头、胸、腹、翅、尾部以及卵管中都不表达。进一步原位杂交结果显示,BmVgR在卵巢的卵母细胞中表达。时期表达谱显示,BmVgR在家蚕雌性个体的整个生命周期中都有表达,只是从胚胎期到幼虫期的五龄第五天表达量一直较低,到卵黄原蛋白(BmVg)在上蔟第一天开始表达的前两天开始上调表达,到化蛹第四、五天表达量最高,该结果显示,BmVgR的上调表达与家蚕卵成熟时期基本一致。3.卵黄原蛋白受体在家蚕白妙卵突变体中的突变检测及表达分析对家蚕vit突变体的BmVgR的cDNA全长进行了克隆,其序列与正常大造的BmVgR比对,发现vit突变体的BmVgR相比大造的缺失两个片段,第一个缺失片段为BmVgR的1680-1832bp位置,氨基酸残基位置为560-609aa,即第一个表皮生长因子前体区域的第三个ClassB区域,该片段的缺失是vit突变体所特有的。第二个片段为BmVgR的3879-3941bp位置,在蛋白的一级结构域上缺失了第二个表皮生长因子前体区域的第一个ClassB区域。Northern杂交分析显示,大造与vit突变体的BmVgR的表达量和大小的差异都不明显。结合已有的研究报道,推测BmVgR的第一个片段缺失对该基因编码蛋白的二聚化,以及与配体结合后的解离,起着十分重要的作用,这可能正是导致vit突变体的卵母细胞不能正常摄取卵黄原蛋白的原因,但要完全明确vit突变体是由于BmVgR突变导致的,还需进一步实验论证。4.家蚕卵黄原蛋白受体的RNAi研究通过dsRNA介导的RNAi技术,本实验对家蚕化蛹第一天的雌蛹进行BmVgR转录沉默,并连续在化蛹第四天、第七天进行干涉。结果显示,注射了dsVgR的雌蛹能正常发育到化蛾,化蛾交配后,所产下的卵中有小卵,卵色偏白,卵的大小不到正常的一半,并且不能孵化；而注射了elution buffer和dsRed的雌蛹也能正常发育,化蛾交配所产的卵大小均一。荧光定量检测结果显示注射了dsVgR的雌蛹化蛾后所产小卵的BmVgR表达量明显比对照低；进一步通过Elisa实验也证实小卵的卵黄原蛋白的含量比对照少很多。dsVgR干涉后获得的小卵其表型和生化分子特征都与vit突变体类似,暗示vit突变体的卵发育异常可能是由于BmVgR基因的缺失导致,其不能正常胞吞卵黄原蛋白进入卵内。已有遗传分析证实,vit突变体同质致死。由此,我们推断BmVgR对于家蚕卵形成是十分重要的,进而推测BmVg是家蚕胚胎发育所不可缺少的。