第一部分硫化氢在D-半乳糖诱导的拟老化动物模型中对中枢性老年性聋的影响研究目的:在D-gal诱导的拟老化模型基础之上,研究硫化氢对中枢性老年聋病理生理过程的影响方法:1月龄Sprague Dawley(SD)大鼠随机分成:①拟老化模型组:予颈部皮下按500mg/kg/天的剂量每天注射D-gal(溶解于0.9%的生理盐水)持续注射8周。D-gal拟老化模型造模结束后再分为3组,一组予NaHS溶液按1.4mg/kg/天的量腹腔给药10天(3月龄拟老化+NaHS组),一组予同样量的生理盐水按同样的时间经腹腔给药(3月龄拟老组),一组继续喂养6个月后再分为两组:ⅰ)予NaHS按1.4mg/kg/天的量经腹腔给药10天(9月龄拟老化+NaHS组),ⅱ)予同样量的生理盐水处理同样的时间(9月龄拟老化组)。②对照组:予与拟老化组同样量的生理盐水注射同样的时间,8周后分为两组,一组继续予生理盐水腹腔注射10天(3月龄对照组),另一组继续喂养6个月后再予腹腔注射生理盐水10天(9月龄对照组)。Western blot检测各亚组PI3K/AKT及AMPK信号在听皮层的磷酸化水平,检测各亚组应激相关蛋白GRP78、laminA/C、laminB1在大鼠听皮层的表达,检测各亚组抗氧化蛋白PRDX-2、TXNRD1在听皮层的表达,检测各亚组线粒体碱基切除修复酶DNAPOLG、OGG-1在听皮层线粒体的表达,检测各亚组OXPHOS复合体在听皮层的表达,检测各亚组分子伴侣HSP90α在听皮层中的表达。酶标仪比色法检测各亚组血清GSH的含量和SOD的活性以及MDA在血清的水平。PCR检测各亚组听皮层线粒体CD的发生率。免疫组化染色法检测各亚组活性形式的Caspase-3和GFAP的表达。尼氏染色法检测各亚组听皮层神经元数量变化。结果:Western blot结果显示,3月龄拟老化组比相应的对照组PI3K/AKT及AMPK信号磷酸化水平增加,而9月龄拟老化组比相应的对照组PI3K/AKT及AMPK磷酸化水平未见有统计学意义的改变;NaHS干预后的3月龄和9月龄拟老化组比未干预组这三个信号的磷酸化水平均有明显升高。3月龄的拟老化组比相应的青年大鼠的GRP78、laminA/C、laminB1 表达增加,而 NaHS 干预组比未干预组 GRP78、laminA/C、laminB1的表达均有下降;9月龄组lamin蛋白表达则相反。PRDX-2、TXNRD1在3月龄和9月龄的拟老化组比相应的对照组表达下降,NaHS处理组比未处理组分别有所增加。DNA POLG、OGG-1在3月龄的拟老化组比相应的对照组表达有轻度的上升,但无统计学差异;在9月龄的拟老化组比相应的对照组表达下降,有显著的统计学差异,在3月龄和9月龄的NaHS处理组比相应的未处理组分别有所增加。OXPHOS复合体在3月龄的拟老化组比相应的对照组表达有所上升,予NaHS处理组比未处理组表达下降,以复合体Ⅰ和Ⅱ的变化更为明显;在9月龄的拟老化组相比于青年组大鼠表达下降,但无统计学差异,NaHS处理组相较于未处理组也无明显变化。HSP90α在3月龄的拟老化组比相应的对照组表达增加,在9月龄的拟老化组比相应的对照组表达下降;予NaHS处理后在3月龄和9月龄大鼠均表达增加。GSH的含量和SOD的活性在3月龄和9月龄的拟老化组比相应的对照组有所下降,NaHS处理组比未处理组分别有所增加。MDA的含量在3月龄和9月龄的拟老化组比相应的对照组增加,NaHS处理组比未处理组含量下降,但在9月龄组中,NaHS处未引起MDA水平的明显差异。线粒体CD在3月龄和9月龄的拟老化组比相应的对照组增加,3月龄的NaHS处理组比相应的未处理组CD减少,但在9月龄的NaHS处理组比相应的未处理组则无明显减少。Caspase-3在3月龄和9月龄的拟老化组比相应的对照组明显增加,NaHS处理组比未处理组分别有所减少。GFAP在各亚组的变化趋势与Caspase-3相似。尼氏染色计数发现,在3月龄和9月龄的拟老化组比相应的青年对照组大鼠神经细胞数量减少,但NaHS处理神经细胞数量都无明显变化。结论:D-gal诱导的拟老化大鼠听皮层氧化应激水平随着年龄的增加而升高,而线粒体功能与修复能力逐渐减退,抗氧化能力、蛋白稳态在拟老化大鼠中也都会逐渐下降,但是外源性地给予NaHS可以降低氧化应激水平,加强线粒体基因损伤修复、增加抗氧化能力和蛋白稳态。因此,NaHS有望成为干预衰老发生发展及其相关疾病的有效手段。第二部分体外研究P13K/AKT及CamKK β/AMPK信号在硫化氢介导的延缓中枢性老年性聋中的作用目的:探讨硫化氢在原代培养的听皮层神经元中对拟老化的影响及其与PI3K/AKT、CamKK β/AMPK信号通路的关系方法:用出生2天以内的SD乳鼠听皮层神经元作原代培养,分成六个亚组:对照组,未予药物干预正常生长的神经元;拟老化组,D-gal诱导的人工体外衰老模型;NaHS干预组,拟老化细胞模型建立后用NaHS处理;LY(LY294002)抑制组,拟老化细胞模型建立后用LY294002抑制PI3K激活,再用NaHS处理;CC(Compound C)抑制组,拟老化细胞模型建立后用Compound C抑制AMPK激活,再用NaHS处理;STO(STO-609)抑制组,拟老化细胞模型建立后用STO-609抑制CaMKKβ激活,再用NaHS处理。β-半乳糖苷酶染色检测各亚组培养的听皮层神经元衰老状态,PCR检测各组神经元CD的发生率。Westernblot检测PI3K/AKT及AMPK信号在各组的磷酸化水平;检测各组应激相关蛋白GRP78、laminA/C、laminB1,抗氧化蛋白PRDX-2、TXNRD1,线粒体DNA碱基切除修复酶DNA POLG、OGG-1,OXPHOS分子伴侣HSP90α在在神经元中的表达。酶标仪比色法检测神经元细胞内GSH的含量以及内源性抗氧化酶SOD、CAT的活性。自由基探针检测ROS水平。流式细胞术检测反映凋亡的annexin V表达水平及反应线粒体功能的△Ψm。化学发光法检测ATP的产生。结果:D-gal诱导的拟老化组中β-半乳糖苷酶染色阳性阳性神经元数目高于对照组,并随D-gal浓度的升高而增多。CD在拟老化组高于对照组,NaHS处理组CD稍低于拟老化组,但无统计学意义。PI3K/AKT及AMPK磷酸化程度在拟老化组高于对照组,NaHS处理后三者磷酸化程度进一步增强;予LY294002、Compound C、STO609抑制剂后,三个信号分子的磷酸化水平都不能被NaHS增加其磷酸化水平。GRP78、laminA/C、laminB1及及胞内的ROS水平在拟老化组比对照组增加,NaHS处理后四者都下调;在PI3K、AMPK、CaMKKβ被抑制后四者在神经细胞内的含量比未抑制组增加。PRDX-2、TXNRD1在拟老化组相对于对照组表达下降,NaHS处理后二者表达相对于未予处理组增加;在PI3K、AMPK、CaMKKβ被抑制组二者不能被NaHS上调其表达。DNAPOLG、OGG-1在拟老化组表达相较于对照组增加,NaHS处理后二者表达再进一步增加;在PI3K、AMPK、CaMKKβ被抑制组二者的表达也不能被NaHS上调。OXPHOS在拟老化神经元中表达升高,NaHS处理可以降低其表达,以复合体Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ较为明显;在PI3K、AMPK、CaMKKβ被抑制组OXPHOS的表达增高,以复合体Ⅰ、Ⅱ较为明显。分子伴侣HSP90α的表达在拟老化组比对照组明显上升,NaHS处理后HSP90α表达再进一步增加。抑制PI3K、AMPK、CaMKKβ后NaHS处理不能使HSP90α表达增高。GSH的含量、SOD、CAT的活性在拟老化神经元中都下降,NaHS处理后三者又增高,在PI3K、AMPK、CaMKKβ被抑制组,三者与未予抑制组相比明显下降。异常膜电位的线粒体数和凋亡细胞数在拟老化组比对照组增加,NaHS处理组可以减少异常膜电位的线粒体和凋亡细胞;PI3K、AMPK、CaMKKβ被抑制的三个组与未抑制组相比,异常膜电位的线粒体数和凋亡细胞数明显增高。胞内ATP含量在拟老化组比对照组减少,在NaHS处理组ATP含量比未处理组增加;在PI3K、AMPK、CaMKKβ被抑制的三个组NaHS介导的ATP含量增加也被抑制。结论:外源性的H2S通过激活PI3K/ATK及CaMKKβ/AMPK信号通路,可以增加拟老神经细胞内的抗氧化系统的功能,增加线粒体碱基切除修复酶的表达,维持线粒体生物合成的功能,减少氧化应激损害及细胞凋亡的发生。