论文部分内容阅读
目的本实验拟通过构建胰岛素样生长因子结合蛋白-4(IGFBP-4)高表达质粒及干扰质粒,并运用脂质体和电转仪转染两种方法转染质粒,通过对比转染效率选取转染效果更好的方法,用最终选择的较高效的转染方法将所构建质粒转染至神经干细胞内,建立IGFBP-4高表达/低表达细胞模型,继而观察IGFBP-4对神经干细胞增殖、分化的影响。方法首先从大鼠脑组织中提取总RNA,RT-PCR扩增IGFBP-4基因,TA克隆扩增PCR产物后将目的基因片段和p EGFP-N1连接,并对阳性克隆进行测序来构建IGFBP-4高表达质粒,IGFBP-4干扰质粒;体外培养神经干细胞,分别用脂质体转染和电转仪转染两种方法向神经干细胞内转染所构建质粒,通过对比转染效率,选取可获得更理想效果的方法,并探寻不同质粒的最优转染条件;根据最优转染条件,转染各种质粒,并运用western blot对各组细胞IGFBP-4含量进行测定;转染后48h使用荧光免疫细胞化学法计数Nestin、GFAP、MAP-Ⅱ阳性表达的细胞数,观察神经干细胞的分化方向;运用i CELLigence实时无标记细胞功能分析仪监测寻找对于E-plate L8板最适的种植密度,并对比在最适种植密度下同一时间点各组细胞曲线的高度。所有数据均采用SPSS17.0软件进行统计分析。结果1成功提取并扩增IGFBP-4基因,重组质粒pEGFP-N1-IGFBP4经酶切和序列分析鉴定与预期设计一致;2运用脂质体Lipofectamine LTX和电转仪CUY21EDITII两种转染方法均成功将质粒导入神经干细胞中,并在干细胞中有效表达,但两种方法转染效率差别明显,脂质体转染效率为30~40%,电转仪转染效率可达80%以上,电转仪转染效率明显高于脂质体转染;3选择电转染方法作为本实验导入质粒的方法,成功转染4组质粒,并获得每种质粒的最优电转染条件为:p EGFP-N1质粒为Pp V(Poration pulse Voltage)350V,Pd V(Driving pulse Voltage)20V,脉冲时间为10ms,循环次数为20次;IGFBP-4高表达质粒的最优条件:Pp V为400V,Pd V为75V,脉冲时间30ms,循环次数50次;IGFBP-4干扰质粒的对照质粒最优条件是:Pp V为400V,Pd V为60V,脉冲时间18ms,循环次数40次;IGFBP-4干扰质粒的最优条件:Pp V为400V,Pd V为35V,脉冲时间20ms,循环次数40次;4对转染成功48h的四组细胞进行western blot实验,发现转染IGFBP-4高表达质粒组细胞表达蛋白IGFBP-4含量明显增高,较对照组提高1倍左右,IGFBP-4干扰质粒组蛋白IGFBP-4含量明显降低,干扰效率达80%,说明成功构建IGFBP-4高/低表达细胞模型;5 i CELLigence实时无标记细胞功能分析仪监测不同种植密度下细胞的生长曲线,最适的种植密度为每孔5×104个细胞;6选取第100h对比各组曲线高度,IGFBP-4高表达组高于其对照组,IGFBP-4干扰质粒组低于其对照质粒组,IGFBP-4高表达组明显高于IGFBP-4干扰质粒组,差别有统计学意义;7免疫荧光观察各组细胞分化情况:IGFBP-4高表达对照组MAP-Ⅱ阳性细胞比例为27.2%,GFAP阳性细胞比例为32.3%;IGFBP-4高表达质粒组神经元细胞标志物MAP-Ⅱ阳性细胞比例为38.0%,胶质细胞标志物GFAP阳性细胞比例为92.0%;IGFBP-4干扰质粒对照组MAP-Ⅱ阳性细胞比例为21.7%,GFAP阳性细胞比例为86.1%;IGFBP-4干扰质粒组MAP-Ⅱ阳性细胞比例为24.3%,GFAP阳性细胞比例为89.6%。IGFBP-4高表达组神经元分化比例大于PEGFP-N1质粒组(P<0.05),IGFBP-4干扰质粒组神经元分化比例较其对照组RNAi-negative control组明显降低(P<0.05)。结论1 IGFBP-4高表达/低表达细胞模型构建成功;2 IGFBP-4促进了神经干细胞的增殖;3 IGFBP-4促进了神经干细胞向神经元方向的分化。