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番茄是一种重要的蔬菜作物,番茄白粉病是番茄生产特别是设施番茄生产重要真菌病害之一,不仅严重影响番茄的质量和产量,还因农药喷施造成环境污染和番茄果实上的农药残留。挖掘和克隆番茄病原相关分子模式(PAMP)激发免疫反应(PTI)的相关基因,可为其持久和广谱抗病育种提供新的基因资源和策略。 本研究以番茄白粉菌(Oidium neolycopersici)诱导番茄(Solanum lycopersicum cvMicroTom)为材料,利用SMART(Switchingmechanismat5′end of RNA transcript)技术构建了高质量的番茄酵母双杂交(Yeast twohybridization, Y2H) AD-cDNA文库,利用不同浓度的 PAMP-壳聚糖对野生酵母进行致死实验确定致死临界浓度,使用高于该浓度的壳聚糖对文库进行筛选,获得可在致死浓度条件下生长的转化子克隆,通过对克隆测序和比对,该序列与番茄组织蛋白酶D抑制子基因(Cathepsin D Inhibitor,CDI)具有100%同源,说明番茄CDI基因是壳聚糖诱导番茄PTI关键基因。对该基因进行生物信息学、表达模式、亚细胞定位等分析,将该基因在感白粉病烟草品种中过表达,获得转基因烟草植株并进行番茄白粉菌致病性分析,转基因植株表现出抗病性,表明番茄 CDI基因参与了番茄白粉病抗性反应途径。因此,番茄 CDI基因可能是番茄 PTI和 ETI信号途径的共有关键信号基因。 主要结果和结论如下: 1)构建了白粉菌诱导番茄Y2H AD-cDNA文库,文库总库容量为3.77?1010 cfu,重组率达到96%,插入片段长400~2000bp,平均长度约为1000bp。随机挑取50个克隆进行测序,利用生物信息学软件进行初步分析,表明获得的文库质量较高。 2)通过逐步提高壳聚糖浓度确定野生酵母 Y187致死临界浓度,并以高于该浓度壳聚糖筛选番茄Y2H AD-cDNA文库,在0.8mg/mL的壳聚糖浓度下得到一个耐受的酵母转化子,提取阳性克隆的质粒并通过PCR扩增检测,插入片段大小为663bp,测序、比对结果表明与番茄组织蛋白酶D抑制子基因(Cathepsin D Inhibitor,CDI)具有100%同源,推测该基因可能参与了番茄 PTI。 3)生物信息学和实时定量 PCR分析表明,CDI基因编码220个氨基酸,在花中的表达水平明显高于其他组织,说明该基因主要在花中表达;番茄 CDI基因在白粉菌诱导12h时在番茄叶片中表达量达到高峰,推测该基因可能参与了番茄与白粉菌互作反应;该基因在用壳聚糖处理番茄叶片后的12h表达量最高,说明该基因在番茄 PTI中起作用。 4)番茄 CDI洋葱表皮亚细胞定位分析发现该基因定位在细胞膜上。 5)采用农杆菌侵染的叶盘转化法,将番茄 CDI基因转化至感白粉菌的珊西烟草中,获得了过表达番茄CDI基因的稳定转化烟草植株,接种白粉菌后,对其进行显微形态学观察,发现白粉菌在转基因烟草不能形成分生孢子梗并诱导了细胞坏死,无法完成整个无性生活周期,说明该基因参与了番茄白粉病抗病反应途径,是一个重要的番茄白粉病抗病相关基因。