家蚕SDR基因家族生物信息学分析及BmSDR50的酶学特征鉴定

来源 :安徽农业大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:YFY2006
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四氢生物蝶呤(BH4,tetrahydrobiopterin)不仅是芳香族氨基酸羟化酶的必须辅酶,还是一氧化氮合酶(NOS)的必须辅因子,其合成不足会导致哺乳动物罹患多种神经性疾病。家蚕(Bombyx mori)属于鳞翅目昆虫,具有遗传背景清晰、生活周期短等优点,利用家蚕突变体资源研究BH4合成调控网络,可以为人类BH4缺乏症的研究和诊治提供理论参考。羰基还原酶(carbonyl reductases,CBR)属于短链脱氢酶(short-chain dehydrogenase,SDR)超家族。虽有学者从家蚕黄体色突变体(lem)的脂肪体分离出两种CBR,二者均可以参与BH4合成途径,目前关于BmSDR超家族的分子信息及参与家蚕BH4合成的BmCBR成员的克隆鉴定鲜有报道。本研究首先以哺乳动物参与BH4合成相关的SDR基因—人类SDR21C1(hCBR1)的氨基酸序列作为比对对象,对家蚕基因组数据库中的SDR超家族成员进行查询,共得到67个BmSDR基因,并分析了它们的种类、进化关系、物理定位、基因结构和保守基序,结果表明这些基因在第3、5、9、10、16和17号染色体上分别形成了一个基因簇。进一步对基因结构和进化树的分析发现,基因结构和物种进化存在一定的联系。通过进化树与结构分析,筛选出5个与hCBR1亲缘关系较近、结构相似的BmCBR,其中BmSDR50具有较为完整的转录表达谱。qRT-PCR结果表明BmSDR50主要在p50(野生型)、ah09(黄体色突变体,lem)和182(黄体色抑制突变体,i-lem)的中肠和脂肪体中表达,在182各发育时期的表达水平均显著高于p50。为了鉴定BmSDR50的酶活与功能特性,我们利用原核表达系统对其进行了重组表达和纯化。分别以1-苯基-1,2-丙二酮、墨蝶呤、9,10-PQ和靛红为底物对BmSDR50重组蛋白进行酶活动力学研究。结果显示,BmSDR50不仅对CBR的经典底物9,10-PQ的亲和力最高,还能有效地催化BH4合成前体墨蝶呤的还原,故推测BmSDR50可能在家蚕BH4合成代谢途径中发挥重要作用。本论文的研究结果为进一步解析家蚕BH4的合成与分子调控机制提供了必要的生物信息学分析,并奠定了一定的实验基础。
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