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目的:观察弥漫性大B细胞淋巴瘤(diffuse large B cell lymphoma,DLBCL)中PI3K/AKT/mTOR的活化状态及其临床病理相关性,从信号传导调控的角度阐述DLBCL的发病机理,以期为DLBCL的诊断以及预后评估提供新的分子指标;从PI3K催化亚单位的层次初步探讨DLBCL中PI3K/AKT/mTOR通路活化的机制;另外建立DLBCL裸鼠移植瘤模型,通过体内实验探讨AKT信号传导通路对DLBCL细胞生长及其生物学效应的影响,以期为DLBCL的治疗提供新的思路。方法:第一部分:收集复旦大学附属肿瘤医院病理科2002-2007年间新鲜DLBCL组织标本及相应石蜡组织75例,其中54例收集到随访资料;同时收集淋巴结反应性增生(reactive hyperplasia,RH)10例做对照。用免疫组织化学(immunohistochemistry,IHC)方法检测上述新鲜组织中pAKT、pmTOR的表达;同时用IHC法观察石蜡组织中Bcl6、CD10和MUM1的表达并据此将DLBCL分为生发中心B细胞样型(germinal center-B cell like,GCB)和non-GCB两型,运用TaqMan实时荧光定量逆转录聚合酶链反应(Real-time quantitativereverse transcription polymerase chain reaction,Real-time RT-PCR)技术检测Bcl6mRNA含量。分析pAKT、pmTOR在DLBCL及RH中表达的差异及其在DLBCL中的表达与分子分型、Bcl6表达及部分临床指标和预后的相关性。第二部分:选取第一部分中54例新鲜组织较多者,实时定量RT-PCR方法检测PI3K4个催化亚单位的mRNA表达;另外收集RH新鲜标本9例同时进行检测。分析4个亚单位相对表达水平的高低,及在DLBCL和RH中表达水平的差异,以及与pAKT表达的相关性。选择76例新鲜DLBCL组织标本,酚-氯仿法提取基因组DNA后针对PIK3CA基因突变热点部位所在片段(外显子9和外显子20)进行PCR扩增及基因突变的检测分析。第三部分:(1)无菌套管针抽吸法建立DLBCL裸鼠皮下移植模型,观察成瘤率和组织形态特点;用IHC法观察其免疫表型;用PCR扩增检测移植瘤组织和LY8细胞株的IgH克隆性重排和基因组DNA微卫星序列。(2)将荷瘤鼠(肿瘤大小均约200-400mm~3)随机分为3组,即对照组、低剂量LY294002组(0.1mg/kg)及高剂量LY294002组(0.5mg/kg),每组含10只裸鼠。每天给药连续10天。每周3次测量各移植瘤的体积(体积=1/2ab~2,其中a,b分别为移植瘤的长短径)。至第14天时牺牲裸鼠,HE染色观察移植瘤组织形态,IHC法检测Ki67表达并测定肿瘤细胞增殖活性,同时行Western blot方法检测AKT活化情况。并计算实体肿瘤质量抑瘤率和体积抑瘤率。(3)将荷瘤鼠(肿瘤大小均约600-800mm~3)随机分为4组,即6h处理组、18h处理组、24h处理组及48h处理组,每组4只裸鼠分别腹腔内注射对照(20%DMSO)、0.02mgLY294002、0.1mgLY294002或1.0mgLY294002。分别于给药一次后6h、18h、24h和48h牺牲裸鼠,采用流式细胞技术(flow cytometry,FCM)检测肿瘤细胞的细胞周期和细胞凋亡。(4)将荷瘤鼠(肿瘤大小均约200-400mm~3)随机分为4组,即单用LY294002(0.5mg/kg)组、单用阿霉素(doxorubicin,DOX)(5.0 mg/kg)组、LY294002(0.5mg/kg)与DOX(5.0 mg/kg)联合用药组以及对照组,每组含10只裸鼠。LY294002为每日给药连续10天,DOX为处理起始第1天和第3天给药。肿瘤体积观测、体积抑瘤率和质量抑瘤率计算、形态学观察及和细胞增殖活性检测大致同(2)。结果:第一部分:(1)pAKT和pmTOR在DLBCL中的阳性率分别为73.3%(55/75)和74.7%(56/75),二者的表达强度、阳性细胞分布基本一致。(2)non-GCB型DLBCL中pAKT和pmTOR的阳性率分别为82.5%(47/57)和84.2%(48/57),显著高于GCB型中的阳性率44.4%(8/18)和44.4%(8/18)(均p＜0.01)。(3)pAKT和pmTOR高表达组的Bcl6蛋白阳性率与mRNA水平均显著低于pAKT和pmTOR低表达或不表达者(均p＜0.01)。(4)pAKT和pmTOR阳性患者中乳酸脱氢酶(LDH)异常者高于阴性患者中的比例,差异达临界统计学意义(p=0.055)。pAKT和pmTOR的表达与性别、年龄、临床分期、KPS评分、B症状之间没有相关性(p＞0.05)。pAKT和pmTOR阳性患者的预后较阴性患者差,但差异没有显著性(p＞0.05)。第二部分:(1)4个催化亚单位在DLBCL中按照mRNA表达水平从高到低依次是PIK3CD,-B,-A和-G。其中PIK3CD表达水平略高于PIK3CB(p＞0.05),显著高于PIK3CA和PIK3CG(p＜0.05)。(2)PIK3CB的表达也显著高于PIK3CA和PIK3CG(p＜0.05),并且PIK3CB在DLBCL中的表达显著高于RH中(p＜0.05)。(3)pAKT阳性组中PIK3CB和PIK3CD的表达水平均显著高于pAKT阴性组(p＜0.05)。(4)76例DLBCL中仅有1例检出了PIK3CA基因的突变,突变率为1.32%。(5)该病例共有3个突变位点,其一为c.1634A＞C,发生在曾报道的热点部位之一;另两个突变位点是c.1658G＞C的颠换和其后单个碱基(T)的缺失(c.1659delT),导致移码突变,该两个突变均未见文献报道,为新发现的突变类型。第三部分:(1)运用LY8细胞株在裸鼠成功进行了人DLBCL细胞的种植,截至本次实验观察时已传至第9代,共移植裸鼠124只,其中114只成瘤,成瘤率达91.1%。每代移植瘤的生长特点均相似:于移植后约2周长出,随后即进入快速生长,约在3周左右长至1000mm~3,4周左右达3000mm~3大小。经病理形态学分析、IHC检测、基因重排检测及基因组DNA微卫星序列检测,表明与人DLBCL细胞相似,证实了移植瘤的稳定性和可重复性。(2)与对照组相比高剂量组LY294002显示出明显的抗肿瘤效应,且大致呈时间依赖性。高剂量LY294002组的肿瘤体积和质量与对照组相比均显著降低(p＜0.01);低剂量组降低不显著(p＞0.05)。与对照组相比低剂量组与高剂量组pAKT表达均显著降低,高剂量组尤其显著。(3)低剂量组和高剂量组LY294002肿瘤细胞增殖活性(Ki67阳性率)显著低于对照组,以高剂量组尤其显著(均p＜0.05)。(4)FCM检测发现6h和18h不同剂量组、24h低、中剂量组及48h中剂量组均显示肿瘤细胞的细胞周期S期细胞比例较对照略有降低而G1期细胞增加,提示出现G1期阻滞,但效果均不显著(p＞0.05)。24h时高剂量组和48h时低剂量组及高剂量组均显示出S期细胞比例明显降低(p＜0.05),提示出现显著的G1期阻滞。其中对细胞周期阻滞效果最显著的是48h时高剂量处理组。另外本试验也显示,LY294002促细胞凋亡的效果不明显(p＞0.05)。(5)与LY294002或DOX单用组及对照组相比,LY294002与DOX联合组荷瘤鼠较早地出现了对肿瘤生长的明显抑制。联合组的肿瘤体积抑瘤率显著优于任何单用组(p＜0.05);而质量抑瘤率显著优于LY294002单用组(p＜0.05),也优于DOX单用组,其差异达临界统计学意义(p=0.057)。通过检测Ki67的表达分析了LY294002对DLBCL肿瘤细胞增殖活性的影响,结果发现LY294002与DOX联用组的肿瘤细胞增殖活性显著低于对照组和任一药物单用组(均p＜0.01)。结论:1.AKT/mTOR信号传导通路活化在DLBCL发生中起重要作用,特别与Bcl6低表达或不表达以及non-GCB亚型密切相关,该信号通路有望成为部分DLBCL治疗的新靶点。2.在DLBCL中PIK3CD和PIK3CB均高表达并且与pAKT的表达显著相关,提示PIK3CD和PIK3CB可能在DLBCL中PI3K/AKT通路的活化中发挥重要作用。PIK3CB在DLBCL中的表达水平显著高于RH,提示其可能参与了DLBCL的发病机制。PIK3CA基因突变在DLBCL中发生率极低,提示其可能不是DLBCL中PI3K/AKT通路活化的主要机制。3.本研究成功建立了人DLBCL裸鼠移植瘤模型,为进一步体内研究提供了较理想的动物模型。利用该模型本研究表明LY294002在体内可以抑制AKT活化从而抑制DLBCL肿瘤的生长,并且主要是通过调节细胞周期而非细胞凋亡,同时可以抑制肿瘤细胞增殖活性。另外LY294002在体内也可以增加化疗药物DOX的肿瘤抑制作用。上述结果与本课题组前期体外实验结果相符,为DLBCL的治疗提供了新的理论依据和思路。本课题的创新性在于:1.从AKT/mTOR信号传导通路的角度探讨DLBCL的发病机制,目前国内尚无相关研究报道,国外仅有一篇相关报道,且未涉及该通路与分子分型及Bcl6表达等相关性的相关研究。本研究探讨了该通路的两个重要分子AKT和mTOR在DLBCL中的活化及其与DLBCL分型以及DLBCL中重要分子Bcl6表达的相关性,并且初步分析了该通路活化与临床指标以及预后的关系。2.关于DLBCL中PI3K/AKT通路的活化机制及DLBCL中PI3K 4个催化亚单位的表达水平目前国内外尚未见相关文献报道。本研究采用实时定量RT-PCR的方法从mRNA水平检测了4个催化亚单位的表达,并初步探讨各个亚单位表达与PI3K/AKT通路活化的关系。3.本研究成功建立了人DLBCL裸鼠移植瘤模型,为进一步体内研究提供了较理想的动物模型;并利用该模型对DLBCL中PI3K/AKT通路的生物学效应进行了研究。目前国内外尚未见相关研究报道。