目的：用双向凝胶电泳(2D-PAGE)技术分析帕金森病(PD)患者和对照（头痛患者）脑脊液中蛋白质，探索脑脊液2D-PAGE适宜的实验方案；比较两组2D-PAGE图谱，寻找有意义的差异蛋白点并对部分差异蛋白点进行初步推测。方法：① 腰椎穿刺收集新诊断的PD患者和头痛患者脑脊液；② 用Bradford法检测脑脊液蛋白质浓度，丙酮沉淀法提取脑脊液中的蛋白质；③ 以固相pH梯度等电聚焦(IPG-IEF)为第一向，垂直平板十二烷基磺酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)为第二向进行2D-PAGE；④ 用银染法对电泳后的凝胶染色，采集凝胶图像并进行图像分析，寻找有意义的差异蛋白点，根据分子量和等电点做初步分析。结果：① 获得了PD患者和头痛患者脑脊液2D-PAGE图谱(pH3-10和pH4-7)。脑脊液2D-PAGE图谱蛋白点分布特点与血清类似，极酸和极碱性蛋白较少，大多数蛋白质为中性或偏酸性蛋白，等电点分布在pH4-8范围；从分子量方面看，大部分蛋白质分布在20kD-100kD之间，70.0kD附近聚集了大量蛋白质，可能为白蛋白；②用ImageMaster 2D国家自然科学基金资助项目 编号30370499<WP=8>图像分析软件对三张PD患者脑脊液蛋白质pH4-7范围的2D-PAGE 图谱进行重复性分析显示：三张图谱检测到的蛋白质点数分别为221 ，232 ，257，点匹配率在85%以上。在每张图谱中选择30个相互匹配的蛋白质点进行比较，其等电点(pI)、在三次实验中分别为5.7562 ±0.3765，5.7587±0.3759，0.5962±0.4553 ，F=0.19(p>0.05，n=30)；分子量(M)为 105.7754±6.8222kD，106.6466±7.515，107.4498±6.2455，F=0.341(p>0.05， n=30)；蛋白质表达量(Volume)为2893.1739 ± 1430.3435，3116.5652±1431.4734，2723.7391±1461.4173，F=0.429 (p>0.05 ，n=30)；显示了较好的重复性；③ PD患者脑脊液pH4-7范围的2D-PAGE图谱上检测到237±18个蛋白点，头痛患者为301±20个，比较两组2D-PAGE图谱显示9个蛋白点在PD患者脑脊液中含量减少，8个蛋白点消失，另有8个蛋白点含量上调；④ 根据蛋白质的等电点和分子量等信息，结合文献及SWISS-2DPAGE数据库中的人类脑脊液蛋白质2D-PAGE图谱，30，31，45可能为血浆铜蓝蛋白(ceruloplasmin，CP)及其前体(ceruloplasmin precursor，CPP);蛋白点261，262，263，264，265可能为结合珠蛋白(haptoglobin)β链，蛋白点274，276，277，278，279，280，281，282，283 可能为载脂蛋白J(apolipoprotein J， ApoJ)片段及前体。⑤ 比较不同成分的水化上样缓冲液溶解蛋白质样本获得的2D-PAGE图谱发现，DTT作为还原剂效果优于TBP，4%浓度的兼性离子去污剂CHAPS效果优于2%浓度，缓冲液中0.25%的SDS仍然对等电聚焦有严重干扰。 <WP=9>结论：以IPG-IEF为第一向，SDS-PAGE为第二向对脑脊液蛋白质进行2D-PAGE能够获得较为理想的2D-PAGE图谱,用Ph4-7的IPG胶条与pH3-10相比能获得分辨率更高的图谱；PD患者与头痛脑脊液蛋白质表达有明显差异，部分蛋白质在PD患者脑脊液中上调、下调甚至消失，对这些差异蛋白进行鉴定并了解它们的功能，在疾病发病和病程进展中的作用将是主要后续工作；由于样品制备是2D-PAGE的关键步骤，选择适宜的实验方案能改进2D-PAGE的分辨率，获得更好的蛋白质分离效果。