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目的:胃癌是我国最常见的恶性肿瘤,在我国其发病率和死亡率居各类肿瘤的首位,因此,寻找胃癌的治疗靶点是当前肿瘤研究领域的热点。许多研究成果显示,激酶信号通路参与肿瘤的发生发展过程,目前已将激酶信号通路确定为肿瘤治疗的靶点,作为未来抗肿瘤药物研发治疗肿瘤的一项新策略。P21活化蛋白激酶1(p21-activated kinase 1,PAK1)作为I类PAK家族的代表,是进化上保守的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶,在肿瘤细胞信号转导过程中具有枢纽作用。PAK1是小G蛋白Rho家族的下游靶蛋白,可被生长因子及其他胞外信号活化,并通过与众多的下游结合蛋白或激酶底物相互作用,调控细胞的生物学功能。PAK1除了能够参与细胞骨架的动态调节,还参与其他生物学功能的调节,如生长因子信号通路、类固醇受体通路、有丝分裂等,特别是在细胞的转化,以及肿瘤细胞的侵袭转移过程中有重要作用,因此已成为有效的肿瘤治疗靶点。但目前针对该靶点抑制剂的研究正处于起步阶段。本研究旨在基于已知的PAK1空间结构,采用计算机辅助药物设计方法,进行活性小分子探针设计、合成后,通过高通量筛选,获得效能较高的PAK1小分子抑制剂。并进一步验证该小分子药物的活性和激酶抑制作用,检测该小分子化合物对胃癌细胞生物学功能的影响并探讨其机制,为PAK1靶向抑制剂的开发及胃癌治疗提供新策略。研究方法:采用Kinase Glo激酶发光法将针对PAK1设计的多种小分子化合物进行高通量筛选,获得有活性的小分子抑制剂AK963/40708899;通过激酶分析实验,检测小分子化合物对PAK1和II类PAK家族成员PAK4和PAK6激酶活性的影响,判断其活性和选择性;将AK963/40708899小分子化合物与PAK1变构抑制剂IPA-3的理化性质进行比较,发现其优势;随后,采用MTT和集落形成实验检测AK963/40708899对胃癌细胞增殖的影响;流式细胞术检测AK963/40708899对胃癌BGC823细胞周期的影响;Western blot及Real time-PCR方法检测AK963/40708899对细胞周期相关蛋白cyclinB1蛋白及其mRNA水平表达情况的影响;探测AK963/40708899引起cyclinB1下调的分子机制;Transwell实验观察AK963/40708899对胃癌细胞迁移及侵袭能力的影响;共焦激光扫描显微镜技术观察AK963/40708899对细胞骨架的影响。细胞粘附实验观察AK963/40708899对胃癌BGC-823细胞与ECM粘附的影响;Western blot检测AK963/40708899对PAK1下游PAK1-LIMKl-Coffilin信号通路的影响;Western blot检测AK963/40708899对PAK1-ERK1/2-FAK信号通路的影响;Real time-PCR检测AK963/40708899对BGC-823细胞IV型胶原分子mRNA表达的影响;Western blot检测AK963/40708899对PAK1下游信号分子MMP-9蛋白表达的影响;计算机模拟小分子化合物AK963/40708899与PAK1蛋白分子的对接情况,揭示化合物AK963/40708899与PAK1蛋白的作用方式。此外,将小分子化合物AK963/40708899与胃癌临床常用化疗药物紫杉醇联合用药,采用MTT和集落形成实验检测联合用药对胃癌细胞增殖的影响;流式细胞术检测联合用药对胃癌BGC823细胞周期及早期凋亡的影响;Western blot检测AK963/40708899对stathmin活性及早期凋亡相关蛋白表达情况的影响,发现联合用药增强胃癌细胞对化疗药物的敏感性并探讨其机制。结果:1、通过Kinase Glo激酶化学发光法筛选出AK963/40708899等多个抑制PAK1激酶活性的小分子化合物,并且选择对PAK1抑制作用最强的AK963/40708899作为研究对象,其中AK963/40708899抑制激酶活性的半数有效浓度IC50=15umol/L。2、在体内或体外,AK963/40708899均能够以剂量依赖的方式抑制PAK1的激酶活性。3、在体外,AK963/40708899在一定程度上也能够抑制PAK4的激酶活性,但其抑制作用明显低于PAK1。而对PAK6激酶几乎无影响。4、综合比较两个化合物的分子性质,发现AK963/40708899化合物具有更高的成药性,适合作为先导化合物用于进一步的结构修饰和药物研发。而化合物IPA-3稳定性差,logP值不符合成药性要求。5、AK963/40708899抑制人胃癌细胞BGC823、SGC7901、MGC803、MKN-1的增殖。6、AK963/40708899诱导人胃癌BGC823细胞细胞周期G2/M期阻滞。7、AK963/40708899抑制PAK1活性,通过NF-κB依赖的方式下调cyclinB1的表达,从而引起G2/M细胞周期阻滞。8、AK963/40708899抑制胃癌细胞BGC823细胞的迁移及侵袭能力。9、AK963/40708899能够引起胃癌细胞BGC823细胞骨架的重排,包括抑制丝状伪足和促进黏着斑复合体的形成,增强胃癌细胞BGC823对ECM的粘附。10、AK963/40708899能够抑制PAK1-LIMKl-Coffilin信号通路的活性。11、AK963/40708899通过抑制PAK1激酶活性抑制下游PAK1-ERK-FAK信号通路。12、在BGC823细胞中,AK963/40708899在mRNA水平下调IV型胶原分子的表达,并在蛋白水平下调PAK1下游信号分子MMP-9的表达。13、化合物AK963/40708899能够作用于PAK1的激酶域,可形成氢键,且与PAK1有较高的亲和力,从而发挥其活性的作用。14、与空白对照和单独用药相比,AK963/40708899和紫杉醇联合用药更能有效抑制胃癌细胞的增殖。15、与空白对照和单独用药相比,AK963/40708899和紫杉醇联合用药更能有效实现胃癌细胞G2/M期阻滞,诱导胃癌细胞早期凋亡。16、AK963/40708899通过抑制PAK1下调stathmin活性,引起微管动力学的改变,并且下调早期凋亡相关蛋白Bcl-2/Bax的表达。结论:1、AK963/40708899在体内体外均能够抑制PAK1的激酶活性,且作用具有一定的选择性。2、AK963/40708899通过NF-κB依赖的方式下调cyclinB1的表达,从而引起G2/M细胞周期阻滞,抑制胃癌细胞的增殖.3、AK963/40708899通过抑制PAK1-LIMKl-Coffilin和PAK1-ERK-FAK两条通路,抑制细胞丝状伪足形成,促进粘着斑复合体的形成,从而抑制胃癌细胞迁移侵袭能力。4、化合物AK963/40708899与PAK1有较高亲和力,并可作用于激酶的活性位点发挥抑制作用。5、AK963/40708899协同增加抗微管类化疗药物紫杉醇的抗肿瘤作用,极大地增强了胃癌细胞对化疗药物的敏感性。