随着核设施、核能源的开发利用，其在造福人类的同时，也给人类的生命安全带来隐患。广岛、长崎原子弹爆炸，切尔诺贝利核电站事故以及2011年发生的日本福岛核泄露事件都说明辐射对人类的威胁日益严峻，辐射与机体损伤的研究也越来越受到重视，放射损伤防护也成为目前辐射生物学研究领域的重点和热点。　　2008年《Science》上发表了一篇TLR5对于辐射防护作用的文章。实验结果表明，TLR5作为一种免疫调节的重要分子，在机体辐射敏感性中也发挥了重要的影响。运用TLR5的激动剂CBLB502可有效改善小鼠照后的存活率。这一研究引起了国际广泛关注，为人们理解电离辐射了提供了新的视角，为电离辐射的防护打开了新的思路。　　Toll样受体（TLRs）是一类跨膜受体，可通过识别以及结合相应的PAMPs而发挥免疫调节功能。目前已经发现有13种TLR家族成员存在哺乳动物中[2]。TLRs介导的信号通路主要包括My88依赖性以及TRIF依赖型，可通过激活下游的NF-kB以发挥抗炎，调节免疫的作用。TLR2受体属于TLRs中的一种，过去认为其主要在促进造血、调节免疫方面发挥作用，对于电离辐射的影响未见研究。而TLR2与TLR5在作用的下游信号通路上有共同之处，因此，很可能TLR2也具有和TLR5类似的抗辐射作用。而且，表达TLR2的细胞比TLR5的更加广谱，可识别大部分广谱的PAMP，因此研究TLR2与电离辐射相关性，对于更好理解TLRs与电离辐射关系，开发新的治疗方式将有重要的意义。本课题基于TLR2基因敲除小鼠来研究TLR2对小鼠辐射敏感性的影响，优势在于可以确定特定基因的性质以及研究它对机体的影响，是目前基因研究的“金标准”。因此，本研究具有一定的可靠性，并可为下一步机制研究奠定较好的基础。　　研究内容：　　1、TLR2基因敲除对小鼠照射后存活情况的影响　　选取野生型小鼠(C57BL/10型，6周，20g)作为对照，观察在照射（5.5Gy、6.5Gy、7.5Gy）及未照射条件下与TLR2基因敲除小鼠存活率的差异，并拟合生存曲线；　　2、激活TLR2对小鼠照射后存活情况的影响　　应用不同剂量和时间的TLR2的激动剂PAM3，观察激活TLR2对小鼠照射后存活情况的影响　　3、TLR2对小鼠照后辐射敏感组织损伤的影响　　取出照后小鼠的胃肠、骨髓、肾、睾丸、肺脏等组织，HE染色观察两组小鼠照后组织学上的差异。　　4、TLR2对细胞照后凋亡、增殖的影响　　（1）用TUNEL法检测TLR2基因敲除小鼠和野生型小鼠照后小肠、睾丸、肺脏组织凋亡的差异；　　（2）应用不同剂量和时间的TLR2的激动剂PAM3处理RAW264.7细胞系和原代脾脏细胞，观察激活TLR2对细胞系及原代脾细胞照射后存活和凋亡情况的影响选取野生型小鼠(C57BL/10型，6周，20g)来源的脾脏细胞作为对照，观察TLR2基因敲除小鼠来源的脾脏细胞在不同剂量照射后细胞存活率和凋亡率的变化情况。　　（3）用BrdU法检测TLR2基因敲除小鼠和野生型小鼠照后骨髓有核细胞增殖能力的差异。　　5、TLR2辐射防护作用的初步分子机制研究　　主要研究其中是否MyD88依赖性，即采用MyD88基因敲除小鼠，观察其照后存活率，比较其与野生型小鼠照后存活率差别。　　6、采用SPSS13.0对实验相关数据进行统计分析。　　实验结果：　　1、TLR2基因敲除增加了小鼠照后死亡率　　（1）连续观察TLR2-/-小鼠12个月，其存活率与野生型C57BL小鼠相比存活率相同，为100％，一般状况良好。TLR2基因对小鼠生存率无影响；　　（2）分别给予TLR2-/-和野生型小鼠5.5Gy、6.5Gy、7.5Gy、8.5Gy照射，连续观察30天，记录其存活情况。第30天时5.5Gy剂量下野生型小鼠存活率为100%，TLR2-/-为100%；6.5Gy剂量下野生型小鼠存活率为100%，TLR2-/-为60%；7.5Gy剂量下野生型小鼠存活率为60%，TLR2-/-为20%；8.5Gy剂量下野生型小鼠存活率为20%，TLR2-/-为0(Fig2C)；对不同剂量照射后30天小鼠存活率进行线性曲线拟合，计算LD50/30，野生型小鼠LD50/30=7.8Gy，TLR2-/-小鼠LD50/30=6.8Gy，DRF=1.15。用Kaplan-Meier生存分析统计生存率差异，6.5Gy、7.5Gy、8.5Gy剂量组两种小鼠的存活率差异均有统计学差异（P<0.05）。　　2、激活TLR2促进小鼠照射后存活　　应用不同剂量和时间的TLR2的激动剂PAM3，观察激活TLR2对小鼠照射后存活情况的影响：发现第30天，在7.5Gy照射剂量下对照组小鼠存活率为60%，而给药组为100%；8.5Gy照射剂量下，对照组存活率为20%，给药组为50%；9.5Gy照射剂量下，对照组存活率为0，而给药组是20%；将两组小鼠30天存活率的生存曲线进行拟合，对照组LD50/30=7.8Gy，给药组LD50/30=8.7Gy（Fig3D）。该结果显示了PAM3作为TLR2受体激动剂对小鼠的辐射防护作用，也进一步确认了TLR2在小鼠电离辐射中发挥的保护作用。　　3、TLR2敲除小鼠照后辐射敏感组织损伤的加重　　小鼠受6.5Gy照射后第5天，取出其骨髓、胃肠、肾脏等辐射敏感组织，HE染色可见野生型小鼠照后骨髓有核细胞数量明显减少，血窦结构紊乱，有部分充血。而TLR2基因敲除小鼠骨髓有核细胞减少更加明显，血窦壁崩塌，骨小梁部分增生，说明骨髓损伤较野生型小鼠严重。肾脏HE切片染色可见，野生型小鼠照后第5天肾小球体积增大，内皮细胞肿胀，可见炎性细胞，毛细血管狭窄，局部出血。TLR2基因敲除小鼠照后肾脏组织大片充血，肾小球部分萎缩，肾小管部分崩解，有炎性细胞浸润，内皮细胞、系膜细胞有不同程度损伤，说明TLR2基因敲除小鼠肾脏损伤较为严重。胃黏膜HE染色，野生型小鼠可见其黏膜大量损坏，粘膜下腺体崩解。TLR2基因敲除小鼠损伤更为严重。　　4、TLR2敲除增加细胞照后凋亡、减缓细胞增殖。　　（1）将野生型小鼠和TLR2基因敲除小鼠同时接受6.5Gy照射，照后第5天取出小肠、睾丸、肺等组织进行TUNEL原位凋亡检测，通过对比分析，发现小肠、睾丸组织中TLR2基因敲除小鼠TUNEL阳性率高于野生型小鼠，特别是在小肠隐窝部位，两者差异更为明显。在肺组织中，两者TUNEL阳性率差异则不如小肠和睾丸组织明显，但是可见到TLR2基因敲除小鼠肺组织炎细胞浸润较野生型小鼠多，且可见肺泡组织结构紊乱；　　（2）激活TLR2对细胞辐射损伤有辐射防护作用，表现为TLR2的激动剂PAM3处理的RAW264.7细胞系和原代脾脏细胞照射后存活率升高而凋亡率显著下降。下调TLR2对细胞辐射损伤有加重趋势；表现为相比野生型小鼠来源的脾脏细胞作为对照，TLR2基因敲除小鼠来源的脾脏细胞在不同剂量照射后细胞存活率均更低，凋亡率更高。　　（3）将TLR2基因敲除小鼠和野生型小鼠进行6.5Gy照射，照后第5天取出骨组织，将骨髓切片进行BrdU染色。结果可见TLR2基因敲除小鼠与野生型小鼠未照射情况下BrdU阳性率无明显差异，但是照射后，TLR2基因敲除小鼠骨髓BrdU阳性率则低于野生型小鼠，说明TLR2基因敲除增强了电离辐射抑制骨髓有核细胞增殖的作用。　　5、MyD88对小鼠辐射敏感性的影响　　未照射情况下，野生型小鼠和MyD88基因敲除小鼠，连续观察12个月，两者存活率没有明显差别，均为100%。给予6.5Gy照射后，野生型小鼠30天后存活率为100%，但MyD88基因敲除小鼠下降为0。说明MyD88在小鼠电离辐射中发挥的保护作用，也佐证TLR2可能通过MyD88途径发挥作用。　　讨论分析：　　辐射生物学界已对电离辐射的生物学防护进行了多年的研究，但是在许多放射损伤中，尤其在急性放射病的治疗研究中，仍然没有良好对策。大多数辐射防护药物主要用于预防，而目前对于电离辐射治疗药物的研究还未取得理想的结果。自从2008年的《Science》上首次将TLR5受体激动剂用于治疗急性放射病模型，并取得很好效果后，TLRs与电离辐射之间的关系开始被人们广泛关注。TLR2作为TLRs家族中的一员，其下游通路与TLR5相似，但其表达的组织较TLR5更多，且能识别大多数已知的模式分子。因此，我们相信TLR2对小鼠电离辐射有着与TLR5类似的关系，且更具有研究意义。　　研究小鼠TLR2与电离辐射之间的关系，我们采用TLR2基因敲除小鼠。“基因敲除”作为基因研究的“金标准”，一直以其可靠性著称。我们用这样的实验材料做研究，理论上结果更加可信。通过对比TLR2基因敲除小鼠与野生型小鼠照后生存率的差异，我们确定了TLR2表达与小鼠电离辐射敏感性呈负相关，深入研究其机制，发现TLR2敲除对小鼠机体辐射敏感组织照后有促凋亡、抑增殖的作用，且该作用是MyD88依赖的。至此，我们对TLR2与小鼠电离辐射敏感性的关系做了讨论，确证其降低辐射敏感性的作用。这个结果丰富了我们对TLRs家族与电离辐射敏感性关系的理解，从而为下一步利用TLR2开发急性放射病治疗方法提供了基础。