论文部分内容阅读
背景：
食管癌是目前常见的消化道肿瘤之一，根据其病理诊断主要分为食管鳞状细胞癌（Esophageal squamous cell carcinoma，ESCC）和食管腺癌（Esophageal adenocarcinoma，EAC）2种类型。ESCC在中国范围内均呈现高发病率状态，尤其在中国河南等地。目前临床上针对ESCC的治疗方法主要为手术、放化疗、及靶向治疗等，但患者5年的总生存率不足20％。因此需要进一步的探讨ESCC的发病机制，从而发现新的治疗方法，改善治疗方案，提高患者的5年生存率。
肿瘤处于复杂的体内环境中，其发生发展是多方面相互作用的产物，受肿瘤微环境（Tumor microenvironment，TME）的影响。TME由肿瘤细胞和多种其他类型的细胞及细胞外基质构成，通过细胞与细胞的直接或间接接触的方式形成相互促进或抑制的调控网络，调节肿瘤内部的免疫状态，促进肿瘤的进展。M2型肿瘤相关的巨噬细胞（Tumor associate macrophages，TAMs）在TME中发挥重要作用，其高表达CD163，可以通过分泌IL10、TGFβ等细胞因子抑制CD8+T细胞对肿瘤细胞的杀伤，而且CCL2与CCR2相互作用可以促进趋化单核细胞并将其极化成M2型TAMs，从而有助于肿瘤微环境的形成并促进癌症的进展。Musashi（MSI）家族是由Musashi基因编码的一类高度进化保守的RNA结合蛋白（RNA binding protain，RBP），包括Musashi1（MSI1）和Musashi2（MSI2）2种蛋白。最初发现在MSI1对神经细胞干性的维持及细胞的分化中发挥重要作用。后续实验发现MSI1对肿瘤的增殖、凋亡等相关，并且MSI1发现可以通过AKT-mTOR信号通路促进炎症应答能力及肿瘤细胞的侵袭能力，但MSI1在TME中对巨噬细胞及CCL2分泌的影响尚不清楚。巨噬细胞在TME中起重要作用，探索MSI1对巨噬细胞的影响能帮助理解其在TME中的作用。
目的：
本文旨在探究肿瘤细胞表达MSI1对巨噬细胞的影响，为ESCC的治疗提供新的思路。
方法：
利用食管癌TCGA数据，根据MSI1的表达值的中位数将其分为MSI1高表达组和MSI1低表达组，分析MSI1的表达水平与患者临床参数及预后的相关性；利用TIMER网站分析MSI1的表达与肿瘤浸润细胞的相关性；qPCR检测食管鳞状细胞癌细胞系上MSI1的mRNA表达情况；利用RNA干扰技术（siRNA）将靶向MSI1的siMSI1序列转入TE1和KYSE70细胞中作为实验组（siMSI1＃1组），以转染si Negative control（siNC）序列的TE1和KYSE70细胞作为阴性对照组（siNC组），用qPCR、Western blot分别检测TE1、KYSE70细胞系siNC组和siMSI1＃1组中MSI1基因的mRNA及蛋白表达水平；qPCR及趋化因子试剂盒分别检测TE1、KYSE70细胞系siNC组和siMSI1＃1组中13种趋化因子的mRNA和蛋白表达水平；利用GEPIA网站分析MSI1与CCL2的相关性；利用GEO食管鳞状细胞癌数据库，将样本按MSI1表达值的高低进行排序，选取10个高表达样本与10个低表达样本进行差异基因分析，将差异基因进行富集分析及GSEA富集分析；用Western blot验证siNC组和siMSI1＃1组中AKT、mTOR及CCL2的表达情况；用迁移实验分析TE1、KYSE70细胞系siNC组和siMSI1＃1组肿瘤细胞上清招募单核细胞的情况，细胞流式检测TE1、KYSE70细胞系siNC组和siMSI1＃1组招募的单核细胞上CCR2的表达情况；用迁移实验分析TE1、KYSE70细胞系siNC组和siMSI1＃1组肿瘤细胞上清对CCR2抑制剂提前预处理的单核细胞招募情况；用siNC组和siMSI1＃1组的肿瘤细胞上清培养磁分选的单核细胞7天后，用显微镜观察细胞的形态，用免疫荧光观察CD163+细胞的比例，用qPCR检测M2型巨噬细胞的表面标记物（CD163、IL10、TGFβ)的表达情况，用流式检测极化的单核细胞上CD163的表达情况。
结果：
1.TCGA数据结果表明患者MSI1的表达水平与临床TNM分期、发生部位相关，低表达MSI1的患者的总生存期更长。TIME网站预测MSI1与巨噬细胞的聚集具有相关性。
2.qPCR及Western blot结果表明siMSI＃1的序列可以有效的沉默TE1、KYSE70细胞上MSI1基因的表达。
3.qPCR及多因子检测结果表明相对于TE1、KYSE70细胞的siNC组，siMSI1＃1组表达较低水平的CCL2，同时GEPIA网站预测MSI1与CCL2的表达具有正相关关系。
4.GEO数据结果表明相对于低表达MSI1的肿瘤细胞而言，高表达MSI1的肿瘤细胞的差异基因主要富集在AKT-mTOR信号通路，Western blot进一步验证TE1、KYSE70细胞系的siMSI1＃1组可以通过AKT-mTOR信号通路抑制CCL2的分泌。
5.迁移实验结果表明相比较于TE1、KYSE70细胞siNC组，siMSI1＃1组的肿瘤细胞上清减少单核细胞的招募。同时细胞流式结果表明siMSI1＃1组招募的单核细胞上CCR2的表达比例也明显降低。当抑制单核细胞上CCR2的表达后，TE1、KYSE70细胞siNC组的肿瘤细胞上清会减少单核细胞的招募。
6.免疫荧光、qPCR及流式结果表明相对于TE1细胞系siNC组，siMSI1＃1组的肿瘤细胞上清不易将招募的单核细胞极化成M2型的巨噬细胞。
结论：
1.在食管癌患者中，MSI1的表达水平与临床TNM分期、发生部位及预后相关。
2.食管鳞状细胞癌细胞系上MSI1通过AKT-mTOR信号通路促进CCL2的分泌，进而招募单核细胞并将其极化成M2型巨噬细胞。
食管癌是目前常见的消化道肿瘤之一，根据其病理诊断主要分为食管鳞状细胞癌（Esophageal squamous cell carcinoma，ESCC）和食管腺癌（Esophageal adenocarcinoma，EAC）2种类型。ESCC在中国范围内均呈现高发病率状态，尤其在中国河南等地。目前临床上针对ESCC的治疗方法主要为手术、放化疗、及靶向治疗等，但患者5年的总生存率不足20％。因此需要进一步的探讨ESCC的发病机制，从而发现新的治疗方法，改善治疗方案，提高患者的5年生存率。
肿瘤处于复杂的体内环境中，其发生发展是多方面相互作用的产物，受肿瘤微环境（Tumor microenvironment，TME）的影响。TME由肿瘤细胞和多种其他类型的细胞及细胞外基质构成，通过细胞与细胞的直接或间接接触的方式形成相互促进或抑制的调控网络，调节肿瘤内部的免疫状态，促进肿瘤的进展。M2型肿瘤相关的巨噬细胞（Tumor associate macrophages，TAMs）在TME中发挥重要作用，其高表达CD163，可以通过分泌IL10、TGFβ等细胞因子抑制CD8+T细胞对肿瘤细胞的杀伤，而且CCL2与CCR2相互作用可以促进趋化单核细胞并将其极化成M2型TAMs，从而有助于肿瘤微环境的形成并促进癌症的进展。Musashi（MSI）家族是由Musashi基因编码的一类高度进化保守的RNA结合蛋白（RNA binding protain，RBP），包括Musashi1（MSI1）和Musashi2（MSI2）2种蛋白。最初发现在MSI1对神经细胞干性的维持及细胞的分化中发挥重要作用。后续实验发现MSI1对肿瘤的增殖、凋亡等相关，并且MSI1发现可以通过AKT-mTOR信号通路促进炎症应答能力及肿瘤细胞的侵袭能力，但MSI1在TME中对巨噬细胞及CCL2分泌的影响尚不清楚。巨噬细胞在TME中起重要作用，探索MSI1对巨噬细胞的影响能帮助理解其在TME中的作用。
目的：
本文旨在探究肿瘤细胞表达MSI1对巨噬细胞的影响，为ESCC的治疗提供新的思路。
方法：
利用食管癌TCGA数据，根据MSI1的表达值的中位数将其分为MSI1高表达组和MSI1低表达组，分析MSI1的表达水平与患者临床参数及预后的相关性；利用TIMER网站分析MSI1的表达与肿瘤浸润细胞的相关性；qPCR检测食管鳞状细胞癌细胞系上MSI1的mRNA表达情况；利用RNA干扰技术（siRNA）将靶向MSI1的siMSI1序列转入TE1和KYSE70细胞中作为实验组（siMSI1＃1组），以转染si Negative control（siNC）序列的TE1和KYSE70细胞作为阴性对照组（siNC组），用qPCR、Western blot分别检测TE1、KYSE70细胞系siNC组和siMSI1＃1组中MSI1基因的mRNA及蛋白表达水平；qPCR及趋化因子试剂盒分别检测TE1、KYSE70细胞系siNC组和siMSI1＃1组中13种趋化因子的mRNA和蛋白表达水平；利用GEPIA网站分析MSI1与CCL2的相关性；利用GEO食管鳞状细胞癌数据库，将样本按MSI1表达值的高低进行排序，选取10个高表达样本与10个低表达样本进行差异基因分析，将差异基因进行富集分析及GSEA富集分析；用Western blot验证siNC组和siMSI1＃1组中AKT、mTOR及CCL2的表达情况；用迁移实验分析TE1、KYSE70细胞系siNC组和siMSI1＃1组肿瘤细胞上清招募单核细胞的情况，细胞流式检测TE1、KYSE70细胞系siNC组和siMSI1＃1组招募的单核细胞上CCR2的表达情况；用迁移实验分析TE1、KYSE70细胞系siNC组和siMSI1＃1组肿瘤细胞上清对CCR2抑制剂提前预处理的单核细胞招募情况；用siNC组和siMSI1＃1组的肿瘤细胞上清培养磁分选的单核细胞7天后，用显微镜观察细胞的形态，用免疫荧光观察CD163+细胞的比例，用qPCR检测M2型巨噬细胞的表面标记物（CD163、IL10、TGFβ)的表达情况，用流式检测极化的单核细胞上CD163的表达情况。
结果：
1.TCGA数据结果表明患者MSI1的表达水平与临床TNM分期、发生部位相关，低表达MSI1的患者的总生存期更长。TIME网站预测MSI1与巨噬细胞的聚集具有相关性。
2.qPCR及Western blot结果表明siMSI＃1的序列可以有效的沉默TE1、KYSE70细胞上MSI1基因的表达。
3.qPCR及多因子检测结果表明相对于TE1、KYSE70细胞的siNC组，siMSI1＃1组表达较低水平的CCL2，同时GEPIA网站预测MSI1与CCL2的表达具有正相关关系。
4.GEO数据结果表明相对于低表达MSI1的肿瘤细胞而言，高表达MSI1的肿瘤细胞的差异基因主要富集在AKT-mTOR信号通路，Western blot进一步验证TE1、KYSE70细胞系的siMSI1＃1组可以通过AKT-mTOR信号通路抑制CCL2的分泌。
5.迁移实验结果表明相比较于TE1、KYSE70细胞siNC组，siMSI1＃1组的肿瘤细胞上清减少单核细胞的招募。同时细胞流式结果表明siMSI1＃1组招募的单核细胞上CCR2的表达比例也明显降低。当抑制单核细胞上CCR2的表达后，TE1、KYSE70细胞siNC组的肿瘤细胞上清会减少单核细胞的招募。
6.免疫荧光、qPCR及流式结果表明相对于TE1细胞系siNC组，siMSI1＃1组的肿瘤细胞上清不易将招募的单核细胞极化成M2型的巨噬细胞。
结论：
1.在食管癌患者中，MSI1的表达水平与临床TNM分期、发生部位及预后相关。
2.食管鳞状细胞癌细胞系上MSI1通过AKT-mTOR信号通路促进CCL2的分泌，进而招募单核细胞并将其极化成M2型巨噬细胞。