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角蛋白酶是一种特异性水解角蛋白的蛋白酶,在角蛋白废弃物生物回收中有着重要的应用前景。但目前面临着催化自然角蛋白底物效率较低的困境。本论文主要围绕芽孢杆菌降解羽毛角蛋白的关键步骤以及角蛋白酶高效表达两方面展开研究,以解决基于角蛋白酶生物转化羽毛角蛋白废物效率低下的问题。主要研究结果如下:（1）利用共培养模式构建人工菌群用于羽毛角蛋白高效降解微生物菌群可以通过菌种之间的分工来分配代谢负担和发挥协同作用,具有有效转化复杂底物的能力和可模块化性。在本研究中,通过分析两株菌降解羽毛角蛋白的体系特征,发现B.licheniformis BBE11-1分泌的角蛋白酶活性低于S.maltophilia BBE11-1,但是细胞外酶系更丰富。基于微生物降解角蛋白的过程是以角蛋白酶为主多因素协同作用的理论基础,开发并优化共培养体系用于羽毛角蛋白降解。结合温度转换策略,在3-L发酵罐中仅48 h后50 g×L-1羽毛的降解率便达到了81.8%,显著地提升了角蛋白酶分泌菌株降解羽毛的效率。（2）解析了半胱氨酸循环代谢过程是芽孢杆菌降解角蛋白的关键步骤半胱氨酸是角蛋白降解的特征产物。在本研究中,通过分析发现半胱氨酸在芽孢杆菌细胞内可通过两步代谢反应产生亚硫酸盐,并且在体外证实亚硫酸盐对角蛋白酶水解羽毛角蛋白具有协同作用。基于此,提出半胱氨酸循环代谢步骤介导了分泌角蛋白酶的芽孢杆菌降解羽毛角蛋白的能力。随后通过构建半胱氨酸代谢和亚硫酸盐转运途径的关键基因缺失菌株,发现突变株△yde D、△Cdo1、△Ast1、△SSU1和△Cdo1△SSU1利用LCys转化产生的亚硫酸盐能力以及降解羽毛角蛋白的能力显著降低。进一步,将角蛋白酶和亚硫酸盐的协同体系植入B.subtilis WB600中并建立代谢模型,通过强化Cdo1和Ast1表达强度,发现菌株BSKer-43-CA和BSKer-566-CA代谢LCys产亚硫酸盐的能力分别提高了69.63%和37.06%,羽毛水解产物中的可溶性蛋白质含量也相应增加35.82%和26.87%。（3）构建并优化了角蛋白酶异源表达系统高活性的角蛋白酶对应着更好的羽毛角蛋白降解能力。在本研究中,通过使用组成型启动子p43可获得活性最高的胞外角蛋白酶Ker Z1。Ker Z1的最适p H和温度分别为10和60℃。利用RBS计算器v2.0预测角蛋白酶翻译水平,发现随着RBS序列移近翻译区域,其对翻译起始效率的影响降低。在-13至-18区域实施饱和突变,筛选获得最佳突变体RBS3的胞外角蛋白酶活性为22600.1 U×m L-1。RBS3在15-L发酵罐中的胞外角蛋白酶活性和生产率分别为426600.3 U×m L-1和15235.7 U×m L-1×h-1。利用角蛋白酶和亚硫酸盐协同水解100 g×L-1羽毛12 h,水解产物中总氨基酸含量达到56.6 g×L-1。（4）工程化前导肽提升角蛋白酶活性前导肽对角蛋白酶的活性表达至关重要。在本研究中,通过逐个截断前导肽二级结构以及前导肽切割位点P1的氨基酸替换证实了前导肽决定了角蛋白酶的胞外活性。通过序列比对和定点突变,得到7个突变体的角蛋白酶活性增加了16%66%。基于三密码子饱和突变,同时修饰了6个位点的氨基酸,利用较小的突变体文库筛选获得最佳突变体2-D12在摇瓶中的角蛋白酶活性达到227300.6 U×m L-1。利用工业化培养基,通过实时控制发酵过程并结合流加补料策略,突变体2-D12在15-L发酵罐中的角蛋白酶活性达到610800.9 U×m L-1,为目前报道的最高水平。2-D12协同亚硫酸盐在12 h内对100g×L-1羽毛的水解率达到90.67%,水解液中的总氨基酸含量为65.8 g×L-1,并包含分子量为1 k Da左右甚至更小的生物活性短肽。