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目的:1.建立一种新的乙型肝炎病毒(hepatitis B virus, HBV)基因分型方法,并应用此方法检测福建省乙肝患者的HBV基因型,了解福建省HBV基因型的分布情况,并探讨基因型与肝纤维化、HBeAg阳性率和HBV DNA水平的关系。2.构建HBV野生型YMDD以及突变型YVDD的标质粒标准品;建立高灵敏度的RT-ARMS-qPCR方法定量检测YMDD及YVDD,并对该方法进行评价,为HBV YMDD耐药突变定量检测奠定基础。方法:1. PCR熔解曲线法检测HBV基因型的建立:根据文献报道的中国HBV B、C型基因组全序列,分别设计B、C型特异性引物,以HBV B、C型的标准质粒为对照标准品,建立一种新的基于PCR的熔解曲线法,根据PCR产物的Tm值判断基因型并经测序验证;评价其灵敏度、特异性及重复性。2. PCR熔解曲线法检测HBV基因型检测效能的评价:分别采用PCR熔解曲线法和市售的HBV基因分型试剂盒对51例HBV感染者进行基因分型,比较两法的一致性,评价PCR熔解曲线法的检测效能。3. PCR熔解曲线法检测HBV基因型的初步临床应用:收集346份HBsAg阳性标本,利用所建立的PCR熔解曲线法检测其基因型,以了解福建省HBV基因型的分布情况,探讨基因型与肝纤维化、HBeAg阳性率以及HBV DNA水平的关系。4. RT-ARMS-qPCR法检测HBV YMDD耐药突变的建立:以pMD-18T为载体,构建拉米夫定耐药相关的YMDD野生株、YVDD突变株质粒标准品,建立RT-ARMS-qPCR的定量标准曲线,并评价检测系统的敏感性、特异性及重复性。结果:1.成功建立了PCR熔解曲线法检测HBV基因型成功建立了检测HBV基因型的PCR熔解曲线法,可以根据Tm值判断HBV基因型。B型Tm值为80.79±0.35,C型Tm值为85.75±0.33;可以对HBV DNA拷贝数≥10~3copies/ml的患者HBV进行分型;重复性好,高(108copies/ml)、中(106copies/ml)、低(104copies/ml)浓度血清Tm值的批内CV值分别为0.15%、0.09%、0.16%。2. PCR熔解曲线法检测HBV基因型检测效能的评价对随机选取的51例HBV感染者进行HBV基因分型,PCR熔解曲线法检测为B型的14份标本中,市售HBV基因分型试剂盒检出14份B型;21份C型标本用市售试剂盒检出全部为C型;16份B/C混合型的标本中,市售试剂盒的检测结果为1份B型,2份C型,13份B/C混合型。两种方法比较,B型结果符合率为100%,C型结果符合率为100%,B/C混合型结果符合率81.25%,总体符合率为94.12%(48/51,Kappa =0.909,P<0.05)。3. PCR熔解曲线法检测HBV基因型的初步临床应用3.1 HBV基因型分布346例HBV感染者中,检出B型190例,占54.91%,C型82例,占23.70%,B/C混合型74例,占21.39%,结果显示福建省乙肝患者中以B型HBV感染为主。3.2 HBV基因型与肝纤维化、HBeAg阳性率以及HBV DNA病毒载量关系346例HBsAg阳性的标本中91例被确诊为肝纤维化,142例标本进行了HBeAg和HBV DNA定量的检测,对其进行基因分型发现,91例肝纤维化标本中检出C型39例,占42.86%(39/91),显著高于C基因型在全部研究对象(346例)中所占的比例23.7%(82/346),而检出B型38例,占41.76%(38/91),低于B基因型在全部研究对象中所占的比例54.91%(190/346);对142例HBV DNA≥10~3copies/ml的患者血清,进行HBV基因分型,结果发现C基因型的病毒载量(HBV DNA)明显高于B型和B/C混合型,且C基因型的HBeAg阳性率87.18%(34/39)亦显著高于B型68.35%(54/79)和B/C混合型41.67%(10/24),差异均有统计学意义(P<0.05)。以上结果证明C基因型与肝病的严重程度有关。4. RT-ARMS-qPCR法定量检测HBV YMDD耐药突变的建立:建立了RT-ARMS-qPCR法定量检测HBV YMDD耐药突变的体系。建立的定量检测YMDD野生株的标准曲线相关系数为0.998986,检测线性范围为102～10~8copies/μl,检测灵敏度为10~1 copies/μl,高、中、低浓度质粒标准品的批内CV值分别为1.06%、1.12%和1.71%,批间CV值为4.88%,;建立的定量检测YVDD突变株的标准曲线相关系数为0.998287,检测线性范围为10~1～10~7 copies/μl,检测灵敏度为10~1 copies/μl,高、中、低浓度质粒标准品的批内CV值分别为0.96%、1.11%和1.29%,批间CV值为2.63%。结论:1.成功建立了PCR熔解曲线法检测HBV B、C基因型,该法有较高的灵敏度、特异性和较好的重复性,分型结果与市售的基因分型试剂盒有较高的符合率,适合于临床基因扩增实验室进行HBV基因分型;2.福建省HBV感染者以B基因型为主;肝纤维化、HBeAg阳性率以及HBV DNA病毒载量与乙肝患者感染HBV的基因型相关,C基因型与重度肝病有关。3.在国内首次建立了RT-ARMS-qPCR法定量检测HBV YMDD耐药突变的检测体系,有较高的敏感度、特异性、重复性以及较宽的检测范围。提供了一种能更早地及时准确地检测出耐药突变及突变类型的检测技术。