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目的: 观察疏肝健脾方药对高脂饲料喂养16周建立的非酒精性脂肪性肝病(Nonalcoholic fatty liver disease,NAFLD)大鼠模型肝组织氧化应激水平和p38MAPK/STAT3及Nrf2/ARE通路的干预作用,研究NAFLD的发病机制以及疏肝健脾方药改善NAFLD的作用机制。 方法: 40只SPF级雄性SD大鼠用随机数字表法随机分为5组:正常组、模型组、疏肝组、健脾组和合方组,每组8只。用高脂饮食建立NAFLD大鼠模型,除正常组大鼠喂养正常饲料,模型组和各用药组均喂养高脂饲料。各组大鼠同时进行相应的中药干预,即正常组和模型组给予蒸馏水灌胃,疏肝组灌服柴胡疏肝散浸膏剂,健脾组灌服参苓白术散浸膏剂,合方组灌服柴胡疏肝散合参苓白术散浸膏剂,每日1次,持续16周。16周末,麻醉大鼠后剖腹,腹主动脉取血分离血清检测血脂、肝功等生化指标;通过H&E染色、油红O染色以及透射电镜观察肝组织病理学变化;检测肝组织氧化应激因子(SOD、GSH-Px、MDA、NO)表达水平;实时定量PCR和Western Blot法分别检测各组肝组织p38MAPK/STAT3通路和Nrf2/ARE通路相关基因和蛋白表达水平。 结果: 1.肝组织病理学观察 (1)H&E染色观察 光镜下观察,正常组大鼠肝组织未见脂肪空泡在肝细胞胞内形成,肝小叶和肝细胞索结构整齐清楚,肝细胞胞核染成蓝色;模型组肝细胞明显肿胀,可见弥漫性脂肪空泡,肝窦受压变窄,肝细胞索结构不清,肝小叶内及汇管区炎症细胞浸润明显。各用药组大鼠肝组织在脂滴分布、肝细胞形态、肝细胞索结构、炎症细胞浸润等方面较模型组均有改善,其中以合方组改善最为显著。 (2)油红O染色观察 光镜下观察,正常组大鼠肝组织偶见橘红色的脂滴在细胞内分布,细胞间隙分明,细胞结构整齐清晰,肝细胞核蓝染;模型组可见大量红染脂滴在细胞内积聚,部分脂滴融合成团,细胞核多被脂滴挤压于一侧,肝窦和肝细胞索结构变形,细胞间隙模糊,细胞结构紊乱;各用药组红染脂滴、肝窦和肝细胞索结构情况优于模型组,以合方组最为显著。以上结果表明:模型组大鼠出现典型的肝脂肪变性,NAFLD造模成功,而疏肝健脾方药干预能改善肝脏脂肪蓄积。 (3)透射电镜观察超微结构 透射电镜下观察,正常组大鼠肝细胞内线粒体数量较多,线粒体内嵴清晰,胞内罕见有脂滴积聚;模型组大鼠肝细胞内线粒体呈肿胀、淡化,内质网和核糖体数量明显减少,部分细胞核固缩,胞浆分布较多糖原颗粒,细胞内可见圆形脂滴,局部细胞膜破损;各用药组可见大鼠肝细胞脂肪变性、线粒体变形、内质网数量减少、核固缩、细胞膜破损等超微结构改变均有不同程度改善,以合方组最为明显。以上结果表明:模型组大鼠肝细胞结构受损,而疏肝健脾方药干预能改善肝细胞损害。 2.生化指标 (1)血脂和肝脂含量 经16周高脂饮食喂养后,模型组大鼠血清TC、TG、LDL-C含量比正常组大鼠均显著增高(P<0.01),而HDL-C含量下降(P<0.05);与模型组比较,各用药组血清TC、TG、LDL-C水平都有所下降,以健脾组和合方组最为明显(P<0.05,P<0.01)。各用药组血清HDL-C上升,尤其是以健脾组和合方组最为明显(P<0.01)。肝脂结果显示,模型组大鼠肝组织TC、TG含量较正常组显著增高(P<0.01);各用药组TC、TG含量较模型组均有所下降(P<0.01,P<0.05),以合方组最为显著(P<0.01)。 (2)血清ALT、AST含量 经16周高脂饮食喂养后,模型组大鼠血清AST含量与正常组比较显著上升(P<0.01);与模型组比较,健脾组和合方组AST明显下降,具有统计学意义(P<0.05),疏肝组AST虽有下降趋势,但无统计学意义(P>0.05)。各组间ALT含量差异均无统计学意义(P>0.05)。 3.肝组织氧化应激指标含量 与正常组比较,模型组大鼠肝组织SOD、GSH-Px含量显著下降(P<0.01),而MDA、NO含量显著增高(P<0.01);各用药组大鼠中,肝组织SOD、GSH-Px含量较模型组均有所上升,健脾组和合方组尤为明显(P<0.01),疏肝组SOD含量上升也有统计学意义(P<0.05);各用药组大鼠肝组织MDA、NO含量均不同程度降低(P<0.05,P<0.01),合方组最为明显(P<0.01)。 4.肝组织p38MAPK/STAT3信号通路基因和蛋白表达水平 与正常组比较,模型组大鼠肝组织p38MAPK及STAT3mRNA表达水平显著上调(P<0.01)。而各用药组p38MAPK及STAT3mRNA表达水平均有下调,与模型组比较有统计学意义(P<0.05,P<0.01)。 与正常组比较,模型组大鼠肝组织p-p38MAPK、p38MAPK、p-STAT3及STAT3蛋白表达均显著上调(P<0.01);与模型组比较,疏肝组p38MAPK、STAT3下调也有统计学意义(P<0.05),健脾组p38MAPK、p-p38MAPK、p-STAT3蛋白表达水平也显著下调(P<0.05,P<0.01),而合方组p38MAPK、p-p38MAPK、STAT3及p-STAT3蛋白表达显著下调(P<0.01,P<0.05)。 5.肝组织Nrf2/ARE信号通路基因和蛋白表达水平 与正常组比较,模型组大鼠肝组织Nrf2、HO-1、NQO1mRNA表达水平显著增高(P<0.01);与模型组比较,疏肝组HO-1mRNA升高有统计学意义(P<0.05),健脾组HO-1、NQO1mRNA表达显著升高(P<0.05,P<0.01),合方组肝组织Nrf2、HO-1、NQO1mRNA表达显著升高(P<0.01)。各用药组Keap-1mRNA表达差异均无统计学意义(P>0.05)。 与正常组比较,模型组大鼠肝组织Nrf2、HO-1、NQO1、GST蛋白表达水平显著增高(P<0.05,P<0.01);与模型组比较,疏肝组HO-1、NQO1蛋白表达水平升高(P<0.05),健脾组中的HO-1、NQO1、GST蛋白表达水平显著升高(P<0.01),合方组Nrf2、HO-1、NQO1、GST蛋白表达水平较模型组升高(P<0.05,P<0.01)。而各用药组Keap-1蛋白表达差异无统计学意义(P>0.05)。 结论: 1.高脂饲料喂养大鼠16周能够成功建立NAFLD大鼠模型,该模型能模拟人类NAFLD发病特点。 2.NAFLD模型大鼠肝组织存在氧化-抗氧化失衡,通过调节肝组织氧化应激水平可能是疏肝健脾方药发挥效果的机制之一。 3.NAFLD模型大鼠肝脏存在着p38MAPK/STAT3和Nrf2/ARE通路相关基因及蛋白过度表达,可能与NAFLD的发生发展及其程度有关。 4.疏肝健脾方药能够显著的下调肝组织p38MAPK/STAT3和上调肝组织Nrf2/ARE信号通路相关基因及蛋白表达水平,调节机体氧化应激水平,以健脾组和合方组尤为显著。但p38MAPK/STAT3信号通路与Nrf2/ARE信号通路之间是否对NAFLD氧化应激存在交汇调控作用有待于进一步研究。 5.本研究结果表明健脾组和合方组改善NAFLD的作用尤为显著,结合“以方测证”理论方法,NAFLD本阶段的主要中医病机可能是肝郁脾虚且脾虚为主。