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目的:邻苯二甲酸二(2-乙基己基)酯(di-(2-ethylhexyl)phthalate,DEHP)作为邻苯二甲酸酯(PAEs)的一种,是我国目前使用最广泛的增塑剂。DEHP可以通过皮肤接触、口腔摄入和吸入等方式进入人体内,从而对人体各个系统造成损伤,我们的前期研究证明,DEHP可引起小鼠睾丸组织和睾丸间质细胞凋亡,但其具体的分子机制尚不清楚,本研究旨在探究ARTS(apoptosis-related protein in the TGF-βsignaling pathway)在DEHP诱导的小鼠睾丸间质细胞凋亡中的作用,并揭示其分子机制。方法:1.为了明确DEHP对小鼠睾丸组织凋亡的作用,用不同剂量的DEHP(0,100,200,400 mg/kg/d)给成年雄性昆明小鼠连续经口灌胃21 d后,分别用Western blot和免疫组化方法检测睾丸组织中Cleaved Caspase-8、Bax、Cleaved Caspase-3和Bcl-2的表达。2.将小鼠睾丸间质TM3细胞系分别用不同浓度的DEHP(0,100,300,500μM)处理48 h后,采用CCK-8法测定细胞活力,采用Western blot和Annexin V-FITC/PI双染法检测细胞凋亡水平。3.采用免疫组化和Western blot检测DEHP对小鼠睾丸组织中ARTS表达的影响;采用Western blot和Real-time PCR检测DEHP对TM3细胞中ARTS表达的影响。4.过表达TM3细胞中的ARTS后,用Western blot和Annexin V-FITC/PI双染色法检测其凋亡水平的变化;敲减ARTS后,再用或者不用DEHP处理细胞,用上述方法检测TM3细胞的凋亡水平。5.用Western blot和免疫组化法检测DEHP对小鼠睾丸组织中p53表达的影响;用Real-time PCR和Western blot检测DEHP对小鼠睾丸间质TM3细胞中p53表达的影响。6.过表达TM3细胞中的p53后,用Western blot和Real-time PCR检测p53对ARTS蛋白和m RNA水平的影响;敲减TM3细胞中的p53,用Real-time PCR和Western blot分别检测ARTS的m RNA和蛋白水平;敲减p53后,再用或者不用DEHP处理TM3细胞,重复以上方法,检测ARTS的蛋白和m RNA表达情况。7.为了明确p53与ARTS之间的调控关系,我们首先用生物信息软件进行预测,发现在ARTS启动子区域存在p53的假定结合位点,接着构建p GL4.2-ARTS prom及突变质粒,并用双荧光素酶报告基因和Ch IP实验,验证p53是否促进ARTS基因转录并明确其在启动子区域具体的结合位点。8.分别过表达及敲减TM3细胞中的p53,并用DEHP处理后,用Western blot和Annexin V-FITC/PI双染法检测细胞凋亡情况。9.分别用0,100,200,400μM的H2O2作用TM3细胞12 h后,用Western blot检测细胞中凋亡蛋白的表达。用N-乙酰-L-半胱氨酸(N-acetyl-L-cysteine,NAC)抑制氧化应激后再用DEHP处理,然后分别用CCK-8法、Annexin V-FITC/PI双染法和Western blot检测TM3细胞活性及凋亡水平。结果:1.小鼠睾丸组织Western blot结果显示,DEHP可显著诱导小鼠睾丸组织凋亡;免疫组化结果显示,DEHP可特异性地增加睾丸组织中间质细胞内Caspase-3的表达,提示DEHP可诱导小鼠睾丸间质细胞凋亡。CCK-8法结果显示,300和500μM的DEHP可显著抑制小鼠睾丸间质TM3细胞的活性(P<0.05);且Western blot结果显示,DEHP可显著诱导TM3细胞凋亡。Annexin V-FITC/PI双染法也表明,DEHP处理可显著增加TM3细胞凋亡率,印证了DEHP确实可诱导小鼠睾丸间质TM3细胞凋亡。2.Western blot结果显示,DEHP处理组中的小鼠睾丸组织中ARTS蛋白表达量显著增加;免疫组化结果显示,睾丸组织中间质细胞内ARTS的表达量特异性增加,提示DEHP可特异性地促进小鼠睾丸组织间质细胞ARTS的表达。Real-time PCR和Western blot结果显示,DEHP可上调小鼠睾丸间质TM3细胞中ARTS的m RNA和蛋白表达。3.ARTS过表达可增加TM3细胞中的Cleaved Caspase-8、Bax和Cleaved Caspase-3的蛋白含量,而减少Bcl-2蛋白含量;Annexin V-FITC/PI双染法显示,ARTS过表达可提高TM3细胞的凋亡率。敲减TM3细胞中的ARTS后,细胞凋亡水平明显下降。同时,敲减ARTS可挽救DEHP诱导的TM3细胞凋亡,表明ARTS在DEHP诱导的小鼠睾丸间质TM3细胞凋亡中发挥着重要作用。4.Western blot结果表明,DEHP处理后,小鼠睾丸组织中p53蛋白表达量显著增加,且免疫组化结果显示,DEHP主要促进小鼠睾丸组织中间质细胞内p53的表达,提示DEHP可特异性促进小鼠睾丸间质细胞中p53的表达;用不同浓度的DEHP处理小鼠睾丸间质TM3细胞后,发现DEHP可上调TM3细胞中p53的m RNA和蛋白含量。5.p53过表达可促进TM3细胞中ARTS的m RNA及蛋白表达,而敲减p53后,TM3细胞中ARTS的m RNA及蛋白含量显著下降;敲减p53还可显著抑制DEHP对ARTS m RNA和蛋白表达的促进作用,提示DEHP可通过p53促进小鼠睾丸间质TM3细胞中ARTS的表达。6.双荧光素酶报告基因及Ch IP结果显示,p53可以通过结合ARTS启动子区域上的RE4位点,促进ARTS基因转录。7.p53过表达可增加小鼠睾丸间质TM3细胞的凋亡率,而敲减p53不仅可以降低细胞的凋亡水平,还可以明显抑制DEHP对TM3细胞凋亡的诱导。8.H2O2处理小鼠睾丸间质TM3细胞,细胞凋亡水平显著提升,且ARTS和p53的表达也显著增加;用NAC抑制氧化应激后,DEHP诱导的细胞凋亡明显减弱,ARTS和p53的表达也显著下降,提示DEHP可通过氧化应激激活p53/ARTS信号通路从而诱导小鼠睾丸间质TM3细胞凋亡。结论:1.DEHP可诱导小鼠睾丸组织中间质细胞及小鼠睾丸间质TM3细胞凋亡。2.DEHP可促进小鼠睾丸组织中间质细胞及小鼠睾丸间质TM3细胞中ARTS的表达;ARTS可诱导小鼠睾丸间质TM3细胞凋亡。3.DEHP可促进小鼠睾丸组织中间质细胞及小鼠睾丸间质TM3细胞中p53的表达,且p53可通过与ARTS基因启动子区域结合而促进小鼠睾丸间质TM3细胞中ARTS的基因转录。4.DEHP通过氧化应激激活p53/ARTS信号通路而诱导小鼠睾丸间质TM3细胞凋亡。