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目的：近年来，临床数据显示胆汁淤积症的发病率逐年增高，已经严重威胁人们的身体健康，成为全球性健康问题，但目前针对该疾病的安全有效的治疗药物和策略却较少。研究发现成纤维细胞生长因子19（fibroblast growth factor19，FGF19）在生理条件下参与胆汁酸的肝肠循环，对抑制肝脏内胆汁酸的合成发挥着重要的作用，成为治疗胆汁淤积症等胆汁酸代谢疾病的潜在治疗药物。然而，长期注射FGF19或通过腺相关病毒（adeno-associated viral vector，AAV）过表达FGF19均会诱发小鼠肝脏产生肿瘤。因此，FGF19的致瘤活性成为制约其临床转化为胆汁淤积症治疗药物的一个关键问题。本文以FGF19CT-βKlotho为结构基础，设计βKlotho结合位点突变的FGF19ΔKLB改构体，以期通过减弱配体诱导的受体二聚化来实现代谢活性与致瘤活性的分离，为FGF19改构体临床转化扫除障碍。
方法：（1）FGF19改构体的设计和制备：基于FGF19CT-βKlotho构建βKlotho结合能力依次递减的FGF19改构体，将构建的野生型FGF19（FGF19WT）及其改构体的质粒转化到感受态细胞BL21（DE3）中，次日挑单克隆，置于摇床，在37℃，200rpm条件下培养，LB培养基的OD600达到0.8-1.0后加入1mM异丙基-β-D-硫代-吡喃半乳糖苷（IPTG），诱导表达4小时；收集菌体；超声破碎菌体后，4℃，12000rpm离心收集沉淀，经变性再蛋白质复性，获得正确折叠的蛋白质；通过镍柱亲和层析法和分子排阻色谱法，分离纯化得到高纯度的目的蛋白（纯度大于98%）。（2）FGF19改构体的βKlotho和FGFR4亲和力分析：运用表面等离子共振（Surface plasmon resonance，SPR）技术对比FGF19WT及其改构体的βKlotho和FGFR4的亲和力。（3）FGF19改构体诱导其受体FGFR4二聚化程度测定：选用内源性高表达FGFR4的人肝癌细胞系HepG2，利用邻位连接技术（Proximity ligation assay，PLA），对比FGF19WT和FGF19ΔKLB诱导受体二聚化程度的强弱。（4）FGF19改构体激活下游信号强度的测定：体外实验，选用H4IIE细胞株，以不同浓度FGF19WT和FGF19ΔKLB刺激细胞15分钟，利用免疫印迹法（Western Blotting，WB）对比两者激活下游信号强度的差异；动物体内实验，选用正常C57BL/6J小鼠，腹腔注射FGF19WT和FGF19ΔKLB，15分钟后取肝脏，利用WB法对比两者激活下游信号强度的差异。（5）FGF19改构体促肝脏细胞增殖活性的评估：选用H4IIE细胞，MTT法检测细胞增殖活性；以正常C57BL/6J小鼠为模型，采用Brdu（5-溴脱氧尿嘧啶核苷）技术，免疫组化检测阳性点；以db/db小鼠为模型，腹腔连续注射FGF19WT和FGF19ΔKLB一个月，免疫组化检测各组小鼠肝脏PCNA、Ki67指标，WB检测PCNA、Ki67蛋白表达水平，进一步，用实时荧光定量聚合酶链式反应（RT-PCR）技术检测肝癌指标AFP、CCNA2、EGFR的mRNA水平；（6）FGF19改构体胆汁酸代谢调控活性的评估：选用正常C57BL/6J小鼠，腹腔注射FGF19WT和FGF19ΔKLB，RT-PCR分析注射后不同时间点肝脏中Cyp7A1的mRNA水平；以db/db小鼠为模型，腹腔连续注射FGF19WT和FGF19ΔKLB一个月，WB分析各组小鼠肝脏中Cyp7A1的蛋白表达水平，采用质谱法测定肝脏中CA、DCA、UDCA、CDCA的含量。（7）FGF19改构体调节葡萄糖代谢活性能力的评估：以db/db小鼠为模型，腹腔连续注射FGF19WT和FGF19ΔKLB一个月，监测并对比血糖水平，给药结束后做糖耐量实验，检测并对比FGF19ΔKLB改善糖耐量的能力。
结果：基于FGF19CT-βKlotho结构，理性构建了βKlotho结合能力依次递减的FGF19改构体，并完成高纯度的FGF19WT及其改构体的制备；通过结构表征证实，FGF19ΔKLB与βKlotho结合力减弱，但不影响其与FGFR4的结合，达到了改构体设计的目的；PLA实验证实FGF19ΔKLB诱导受体二聚化的程度明显降低；细胞实验和动物实验都证明FGF19ΔKLB对FGFR下游信号的激活能力减弱；结合体外细胞实验和动物体内实验证明，FGF19ΔKLB能够明显降低肝脏的促增殖能力，但依然保留其胆汁酸和葡萄糖代谢活性。
结论：基于FGF19CT-βKlotho结构设计非促肿瘤型改构体FGF19ΔKLB能够在保留胆汁酸和葡萄糖代谢调控的同时，明显减弱其促增殖活性，规避了致瘤性，有望成为临床上治疗胆汁淤积症或者二型糖尿病的潜在药物。
方法：（1）FGF19改构体的设计和制备：基于FGF19CT-βKlotho构建βKlotho结合能力依次递减的FGF19改构体，将构建的野生型FGF19（FGF19WT）及其改构体的质粒转化到感受态细胞BL21（DE3）中，次日挑单克隆，置于摇床，在37℃，200rpm条件下培养，LB培养基的OD600达到0.8-1.0后加入1mM异丙基-β-D-硫代-吡喃半乳糖苷（IPTG），诱导表达4小时；收集菌体；超声破碎菌体后，4℃，12000rpm离心收集沉淀，经变性再蛋白质复性，获得正确折叠的蛋白质；通过镍柱亲和层析法和分子排阻色谱法，分离纯化得到高纯度的目的蛋白（纯度大于98%）。（2）FGF19改构体的βKlotho和FGFR4亲和力分析：运用表面等离子共振（Surface plasmon resonance，SPR）技术对比FGF19WT及其改构体的βKlotho和FGFR4的亲和力。（3）FGF19改构体诱导其受体FGFR4二聚化程度测定：选用内源性高表达FGFR4的人肝癌细胞系HepG2，利用邻位连接技术（Proximity ligation assay，PLA），对比FGF19WT和FGF19ΔKLB诱导受体二聚化程度的强弱。（4）FGF19改构体激活下游信号强度的测定：体外实验，选用H4IIE细胞株，以不同浓度FGF19WT和FGF19ΔKLB刺激细胞15分钟，利用免疫印迹法（Western Blotting，WB）对比两者激活下游信号强度的差异；动物体内实验，选用正常C57BL/6J小鼠，腹腔注射FGF19WT和FGF19ΔKLB，15分钟后取肝脏，利用WB法对比两者激活下游信号强度的差异。（5）FGF19改构体促肝脏细胞增殖活性的评估：选用H4IIE细胞，MTT法检测细胞增殖活性；以正常C57BL/6J小鼠为模型，采用Brdu（5-溴脱氧尿嘧啶核苷）技术，免疫组化检测阳性点；以db/db小鼠为模型，腹腔连续注射FGF19WT和FGF19ΔKLB一个月，免疫组化检测各组小鼠肝脏PCNA、Ki67指标，WB检测PCNA、Ki67蛋白表达水平，进一步，用实时荧光定量聚合酶链式反应（RT-PCR）技术检测肝癌指标AFP、CCNA2、EGFR的mRNA水平；（6）FGF19改构体胆汁酸代谢调控活性的评估：选用正常C57BL/6J小鼠，腹腔注射FGF19WT和FGF19ΔKLB，RT-PCR分析注射后不同时间点肝脏中Cyp7A1的mRNA水平；以db/db小鼠为模型，腹腔连续注射FGF19WT和FGF19ΔKLB一个月，WB分析各组小鼠肝脏中Cyp7A1的蛋白表达水平，采用质谱法测定肝脏中CA、DCA、UDCA、CDCA的含量。（7）FGF19改构体调节葡萄糖代谢活性能力的评估：以db/db小鼠为模型，腹腔连续注射FGF19WT和FGF19ΔKLB一个月，监测并对比血糖水平，给药结束后做糖耐量实验，检测并对比FGF19ΔKLB改善糖耐量的能力。
结果：基于FGF19CT-βKlotho结构，理性构建了βKlotho结合能力依次递减的FGF19改构体，并完成高纯度的FGF19WT及其改构体的制备；通过结构表征证实，FGF19ΔKLB与βKlotho结合力减弱，但不影响其与FGFR4的结合，达到了改构体设计的目的；PLA实验证实FGF19ΔKLB诱导受体二聚化的程度明显降低；细胞实验和动物实验都证明FGF19ΔKLB对FGFR下游信号的激活能力减弱；结合体外细胞实验和动物体内实验证明，FGF19ΔKLB能够明显降低肝脏的促增殖能力，但依然保留其胆汁酸和葡萄糖代谢活性。
结论：基于FGF19CT-βKlotho结构设计非促肿瘤型改构体FGF19ΔKLB能够在保留胆汁酸和葡萄糖代谢调控的同时，明显减弱其促增殖活性，规避了致瘤性，有望成为临床上治疗胆汁淤积症或者二型糖尿病的潜在药物。