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肺动脉平滑肌细胞(PASMCs)异常增殖是缺氧肺动脉高压肺血管重建的基本病理变化。在此病理过程中，多种细胞因子、生长因子通过细胞内信号传递途径将细胞外增殖信号传至核内，在核内调节基因表达，启动细胞增殖反应。但细胞正常生长的调控是正、负调控因子相互作用和平衡调节的结果。目前关于血管平滑肌细胞(VSMCs)生长调控机制的研究多侧重于正调控因子，对其负调控因子的研究则较少。 细胞因子信号负调控因子(SOCSs)是1997年以来相继被发现的具有负性调控细胞因子信号通路功能的蛋白家族。目前仅对SOCS1和SOCS3了解的较为清楚，其广泛表达于不同类型的组织和细胞中。作为SOCS家族的主要成员SOCS1和SOCS3是否可能作为一个负调控因子抑制VSMCs增殖?目前尚无相关报导。本研究通过观察缺氧条件下SOCS1和SOCS3基因在大鼠PASMCs中的表达变化；并将SOCS3真核表达载体转染入体外培养的大鼠PASMCs内，检测转染前后PASMCs在正常及缺氧培养时细胞增殖及细胞癌基因的表达变化，探讨SOCS3基因在缺氧PASMCs增殖中的作用。 研究内容： 1．原代培养PASMCs并鉴定后，RT-PCR检测常氧及缺氧条件下SOCS1基因mRNA表达变化；RT-PCR、免疫细胞化学和Western blot法检测SOCS3基因mRNA和蛋白表达变化。 2．应用lipofectamine 2000转染试剂将SOCS3表达载体和筛选载体共转染入PASMCs中，G418筛选。RT-PCR、免疫细胞化学法鉴定。 3．~3H-TdR掺入实验、流式细胞仪检测常氧及缺氧条件下转染前后细胞增殖变化。 4．RT-PCR和Western blot检测常氧及缺氧条件下转染前后细胞STAT3 mRNA表达和STAT3蛋白活性变化；RT-PCR检测细胞癌基因c-myc、c-fos、c-jun mRNA表达变化。 结果： 1．原代培养的大鼠PASMCs经α-SM-actin免疫细胞化学染色得到证实。常氧及第三军医大学博士学位论文缺氧条件下PASMCs中，RT一PCR未检测到PASMCs SOCSlllzRNA表达;RT一PCR、westem blot法在常氧条件下PASMCs中未检测到SOCS3表达，在缺氧作用ZhPASMCS中SOCS3表达升高，6h达高峰，12h下降，24h消失，其mRNA和蛋白表达变化一致;免疫细胞化学结果示SOCS3蛋白仅在PASMCS胞浆内表达。 2.共转染细胞经G4 1 8(15O拼留nil)筛选后获得阳性细胞克隆;RT一PCR和免疫细胞化学法证实SOCS3基因转染组细胞中SOCS3 n1RNA和蛋白水平均有强烈表达。 3.正常以SMCs在缺氧6h开始出现G丫G;期细胞比例减少、S+GZ似期细胞比例增加及3H一TdR掺入量的增加，且随缺氧时间延长上述变化更为显著。而转染socS3基因PASMCs在缺氧24h出现G丫G，期细胞比例减少、S+GZ/M期细胞比例增加;3H一TdR掺入量在缺氧6h开始增加，但升高幅度较小;与同时相点正常PAsMcs相比，转染SOCS3基因PASMCs在各时相点G夕G，期细胞比例显著升高，S十Gz/M期细胞比例及3H一TdR掺入量显著降低。 4.正常和转染SOCS3基因PASMCs在常氧条件下中均检测到STAT3 mRNA表达，缺氧作用ZhPASMCs中SprAT3mRNA表达量升高，6h达高峰，12h开始降低，但仍明显高于同组未缺氧细胞;且正常和转染SOCS3基因PASMCs在常氧和缺氧各时相点STAT3 mRNA表达量无显著差异。Westem blot检测结果示正常细胞组pTyr7os一STA’r3蛋白水平于1 Zh达高峰，其他缺氧组51肖r3蛋白的酪氨酸磷酸化水平显著高于未缺氧组;而转染SOCS3基因PASMCs pTyr7OS一STAI，3蛋白水平未随缺氧时间的延长而升高，且各时相点细胞pTyr705一51诱J3蛋白水平显著低于同时相点正常细胞。 5.正常PAsMcsc一myc mRNA表达量在缺氧Zh开始升高，4h达高峰，6h开始降低，24h降至正常水平。而转染sOCS3基因PASMCsc一myc mRNA表达量升高幅度较小，除缺氧4h细胞较未缺氧细胞变化显著外，其他各时相点间无显著差异;且PsN组各时相点细胞c一myc mRNA表达量显著低于同时相点正常组。 6.正常PASMCsc一fos mRNA表达量在缺氧Zh达高峰，缺氧4h下降，6h恢复正常，sh再次达高峰，24h恢复正常。而转染SOCS3基因PASMCs在缺氧条件下c一fosmRNA表达量升高幅度明显降低，缺氧4h、sh显著高于同组未缺氧组，但其表达量显著低于同时相点正常PASMCs，其余各时相点细胞c一fos mRNA表达量与同时相点正常细胞无显著差异。 7，正常PAsMese一un mRNA表达量在缺氧Zh升高，6h达高峰，sh下降，12h恢复正常。而转染SOCS3基因PASMCsc一un mRNA表达量未随缺氧时间的延长而升第三军医大学博士学位论文高;转染SOCS3基因PASMCs在缺氧Zh、4h、6h、8 he一un mRNA表达量显著低于同时相点正常细胞，其余时相点c习un mRNA表达量与同时相点正常细胞无显著差〔己夕十。 结论: 1.正常大鼠队SMCs未检测到SOCSI、SOCS3基因表达。缺氧可诱导大鼠PASMCs SOCS3基因表达，不能诱导SOCSI基因表达。 2.利用脂质体成功将SOCS3表达载体和筛选载体共转染至原代培养的大鼠以 SMCs中，RT一PCR、免疫细胞化学法证实SOCS3基因在细胞内的高效表达。 3.缺氧可能通过诱导51沪口，3的表达和活化及c一myc、c一fos、cjun细胞癌基因的表达而促进PASMCs增殖。 4.soCS3蛋白可能通过阻止STAT3蛋白的酪氨