目的内分泌治疗在乳腺癌治疗中发挥重要的作用,以雌激素受体(ER)为作用靶点的他莫昔芬出现,改变了女性内分泌治疗的历史。但是,他莫昔芬能够兴奋机体部分雌激素受体,引起子宫内膜癌等不良反应。雌激素受体纯抑制剂氟维司群被批准用于晚期乳腺癌,该药物不仅能够竞争性结合雌激素受体,而且能够通过结合ER使其免于分子伴侣HSP90的保护,降解ER受体的表达,成为芳香化酶抑制剂辅助治疗失败后一线标准治疗方法。但其生物体内活性和利用率有限。HSP90是分子伴侣家族中一员,参与多种蛋白的折叠、转运、降解。HSP90与乳腺癌发生、发展、耐药关系密切:首先,与雌激素受体阳性乳腺癌细胞增殖相关的ER/PR是HSP90的伴侣蛋白;其次,与乳腺癌耐药相关的PI3K/AKT信号通路中AKT是HSP90的伴侣蛋白;同时,HER2、Raf也是HSP90的伴侣蛋白。因此HSP90在乳腺癌中的作用尤为值得研究。西黄丸用于乳腺癌的治疗始于1740年,由清代名医王维德所创并载于《外科证治全生集》,其后多本古籍提及其在乳腺癌治疗中作用。西黄丸由乳香、没药、牛黄、麝香组成。现代药理学研究发现,西黄丸在乳腺癌、肺癌、结肠癌以及恶性肿瘤淋巴转移方面有治疗作用,但是对其作用机制尚没有深入的研究。为了解多靶点、多成分的西黄丸处方用于乳腺癌治疗的作用机制,本研究通过采用网络药理学、分子对接预测西黄丸抗乳腺癌的主要活性成分和作用靶点。并通过体内外实验对其进行验证。方法:1.应用台盘蓝拒染法、CCK8细胞毒活性实验,检测西黄丸及各单药、西黄丸主要活性成分对ER阳性细胞株,HER2阳性细胞株,以及三阴性乳腺癌细胞株增殖作用;采用裸鼠乳腺癌细胞株(T47D,SKBr3)移植瘤,检测西黄丸及其单药对不同分子分型乳腺癌细胞株的体内移植瘤的抑制作用;应用PNCA免疫组化检测西黄丸及各单药对移植瘤增殖作用。2.应用流式细胞,Annexin V-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒,PI试剂分别检测西黄丸及各单药、西黄丸主要活性成分对ER阳性细胞,HER2阳性细胞,以及三阴性乳腺癌细胞株凋亡和周期的影响;应用TUNEL试剂盒检测裸鼠移植瘤凋亡作用。3.应用Wound-healing实验和Transwell小室实验,检测西黄丸及各单药对ER阳性阳性细胞株,HER2阳性细胞株,以及三阴性乳腺癌细胞株细胞迁移作用。4.应用TTD数据库,查找现有临床、在研的乳腺癌药用靶点,并参考相关文献构建乳腺癌分子靶点。应用TCMSP数据库,查找西黄丸各单药的药物成分,并应用PUBCHEM查询药物成分的3D结构,进而采用Chemmaper查询药物成分的预测靶点。应用cytoscape构建分析西黄丸各单药成分的靶点和乳腺癌分子靶点,绘制各单药成分-靶点图谱,预测西黄丸各单药对乳腺癌发挥作用的主要活性成分和靶点。应用systemsDock对西黄丸主要活性成分和靶点进行分子对接,分析其与靶点作用的结合位点和结合亲和力。5.对预测的结果进行实验验证,Western blot验证靶点蛋白表达情况,免疫荧光验证靶点蛋白细胞内表达特点,对于预测靶点蛋白之间相互作用应用免疫共沉淀进行检测,异种移植瘤中蛋白表达进行免疫组化检测,RNA-seq实验及RT-PCR实验同时检测西黄丸对转录组的影响。采用ITC实验(等温滴定量测法)验证主要活性成分与雌激素受体结合情况。6.CCK8细胞毒活性实验,比较西黄丸抗乳腺癌活性成分与相对应的靶点抑制剂对不同乳腺癌细胞株抑制作用。结果:1.西黄丸对ER阳性细胞株MCF-7、T47D,西黄丸(XH)半抑制浓度(IC50)分别为49.39μg/mL,43.78μg/mL,对HER2阳性乳腺癌细胞株和三阴性乳腺癌细胞株,西黄丸IC50分别为105.50μg/mL,138.70μg/mL。2.在西黄丸处方中,没药、乳香、牛黄、麝香为30:30:4.5:1,但是牛黄、麝香在四株乳腺癌细胞株中,IC50均大于200μg/ml,因此,牛黄、麝香在西黄丸中直接抑制增殖作用较弱。3.西黄丸及其单药对体内乳腺癌细胞移植瘤也有抑制作用。西黄丸对ER阳性乳腺癌细胞T47D移植瘤抑瘤率为72.54%,对HER2阳性乳腺癌细胞株SKBr3移植瘤的抑瘤率为56.05%。4.西黄丸及其主要成分没药、乳香均能够阻滞细胞周期、诱导细胞凋亡,抑制细胞迁移。5.网络药理学预测发现,西黄丸具有多成分、多靶点的特点;其中西黄丸中,乳香、没药、牛黄、麝香分别有120,264,16,19个活性成分;分别可以预测到641,645,369,621个作用靶点;其中与乳腺癌相关的靶点分别为30,34,21,33个。6.西黄丸抗乳腺癌的主要的活性成分是,20α-hydroxy-4-pregnen-3-one(20αHP),Guggulsterone,Guggulsterol V,Guggulsterone M,Guggulsterol-I(具有共同的环戊烷并氢化菲结构);Olibanumol I,Acetyl-β-boswellic acid,Acetyl-α-boswellic acid,β-boswellic acid(五环三萜类物质)。主要的作用靶点是ERα,HSP90,VEGF,EGFR,Bcl-2。7.实验研究证实,西黄丸能够阻断ERα与HSP90的结合;通过蛋白酶体途径促进ERα的降解,并阻碍ERα的入核。西黄丸并不影响ERα的mRNA表达也不影响HSP90蛋白及mRNA表达。但西黄丸能够降低其他HSP90伴侣蛋白EGFR,HER2,ErbB3,Raf,Erk,Akt的表达。8.ITC实验证实西黄丸的主要活性成分Guggulsterone能够与ERα结合,结合系数(Ka,ΔH,ΔS)分别为:348±24.4/M,-2037±24.4cal/mol,5.06cal/mol/deg。相同ERα蛋白及实验条件下,雌激素与ERα结合的Ka,ΔH andΔS值分别为652±100/M,-1770±16.23 cal/mol,7.17 cal/mol/deg。9.只能与ERα结合的西黄丸的主要活性成分Guggulsterone和20αHP,能够抑制ER阳性细胞株的活性但对HER2阳性的细胞株、三阴性乳腺癌抑制作用微弱。能够结合HSP90的西黄丸主要活性成分Acetyl-β-boswellic acid,Acetyl-α-boswellic acid,β-boswellic acid对ER阳性细胞株、HER2阳性的细胞株、三阴性乳腺癌均有明显的抑制作用。结论:西黄丸能够抑制多种乳腺癌细胞活性,但对ER阳性的乳腺癌更加敏感,西黄丸的主要作用机制主要是阻碍ERα与HSP90的结合;通过蛋白酶体途径促进ERα的降解,并阻碍ERα的入核。其主要活性成分是20α-hydroxy-4-pregnen-3-one(20αHP),Guggulsterone,Guggulsterol V,Guggulsterone M,Guggulsterol-I;Olibanumol I,Acetyl-β-boswellic acid,Acetyl-α-boswellic acid,β-boswellic acid。