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牙鲆在胚后发育过程中有一个剧烈的变态发育过程,其组织、器官以及形态等都发生了剧烈的变化,涉及了许多生物学变化过程。microRNA(miRNA)是一类内源性的非编码小单链RNA分子,长度为18～25 nt,广泛存在于从线虫到果蝇以及人的多种组织器官中,对动植物的生长、发育、疾病发生等生物学过程起着重要的调控功能。miRNA作为动物发育中一个关键的调控因子,其在牙鲆变态发育中的相关研究到目前还未见报道。本论文主要从miRNA对牙鲆变态发育的影响出发,鉴定变态过程中表达的miRNA、筛选不同发育时期表达差异的miRNA,并进一步分析了牙鲆变态过程中miR-1、miR-133和miR-206的表达及其对变态发育可能的调控作用,为揭示牙鲆变态发育的机制提供新的研究依据。首先,利用新一代测序技术(Solexa sequencing)分析了牙鲆变态过程中的小RNA表达,统计分析了不同长度的小RNA的分布,发现测序的小RNA长度主要分布在20-23 nt区域。通过对测序的小RNA数据与miRBase 13.0中的miRNA序列进行了比对分析,结果鉴定了140个的成熟miRNA和57个的成熟miRNA*s,又利用PCR克隆得到了20个miRNA的前体序列并通过RNAfold软件分析了它们的二级发夹结构,进一步验证了这些miRNA的真实性,同时分析了这些miRNA前体的保守性。为了验证这些鉴定的miRNA,通过荧光定量PCR、Northern blot以及miRNA芯片技术对这197个牙鲆miRNA进行了实验验证,进一步确定了这些miRNA的真实性以及Solexa测序用于鉴定miRNA的可靠性。根据miRNA在动物系统发育中的保守性分布,这197个牙鲆miRNA(归属84个miRNA家族)被分为5个类群,有些miRNA家族在所有动物中都表达,有些只在脊椎动物中表达;有些miRNA在物种进化过程中其非“种子”区的某些碱基发生了替换,这些碱基替换发生在特定的物种,是物种特异的,比如miR-21在鱼类与哺乳类中存在一个碱基差异,miR-29a在牙鲆与其它3种鱼中存在一个碱基差异。牙鲆变态过程中miRNA的鉴定为进一步研究牙鲆变态发育的分子调控机制提供了新的参考依据。然后,为了进一步对牙鲆miRNA进行功能研究,利用miRNA芯片技术对两个不同变态发育时期(17和29 dph,days post hatching)的miRNA进行了差异表达分析,筛选得到了66个差异表达的miRNA。进一步分析发现,这些miRNA与牙鲆变态过程中的组织、器官以及形态学变化有着密切的关系,比如miR-25是与色素变化相关的,miR-203是皮肤特异的,miR-1、miR-133和miR-206是肌肉发特异的,miR-126是心血管发育相关的。该研究结果对进一步探讨miRNA在牙鲆变态发育过程中的功能提供了重要的依据。根据甲状腺激素能够促进牙鲆的变态发育以及miRNA芯片差异表达筛选结果,利用荧光定量PCR技术分析了miR-1、miR-13a和miR-206a在牙鲆变态发育中的表达情况,旨在进一步探讨这三个miRNA在牙鲆变态发育中对肌肉发育的调控作用。首先检测了这三个miRNA在牙鲆成体不同组织中的表达,结果发现miR-1和miR-133a主要在心脏和肌肉中表达,miR-206a主要在肌肉中表达。接下来检测了这三个miRNA在牙鲆正常、甲状腺素促进和硫脲抑制的变态发育过程中的表达情况,结果显示,在变态过程中甲状腺素能显著促进miR-1和miR-206a的表达,在一定程度上抑制miR-133a的表达。为了进一步去探讨这三个miRNA的功能,我们利用miRNA靶基因预测程序RNAhybrid预测了它们的靶基因,结果得到了13个miR-1的候选靶基因,8个miR-133a的候选靶基因以及16个miR-206a的候选靶基因。已有研究显示,在肌肉发育中,miR-1和miR-206促进成肌细胞的分化,miR-133抑制成肌细胞的分化而促进成肌细胞的增殖。因此,我们推测,在牙鲆变态发育早期,甲状腺素促进了miR-1和miR-206a的表达,启动了成肌细胞的分化,促进了牙鲆的幼体型肌肉转变为成体型肌肉,从而进一步加速了牙鲆的变态过程,其详细的分子调控机制还有待于进一步实验研究。MyoD、Myf5和Myogenin是肌肉发育中起关键作用的肌肉调节因子,它们在肌肉发育早期的成肌细胞的决定、分化以及增殖中发挥着重要的作用。并且已有研究显示,MyoD、Myf5和Myogenin在肌肉发育相关的miR-1、miR-133和miR-206的转录调控中也扮演着重要的作用。因此,我们分析了这三个肌肉调节因子在牙鲆变态发育过程中的表达情况,旨在探讨它们在牙鲆变态发育中对肌肉发育的调控作用。结果显示,在牙鲆变态发育期间,MyoD高丰度表达,在变态早期,甲状腺素显著促进它的表达,在变态后期硫脲抑制了它的表达;Myf5的表达显著低于MyoD的水平,但在整个变态期间,甲状腺素对它的促进作用最显著,而在变态后期,其表达水平也明显受到硫脲的抑制;Myogenin的表达最弱,在变态后期,甲状腺素抑制了它的表达,而硫脲却显著地促进它的表达。这说明MyoD、Myf5以及Myogenin基因在牙鲆变态发育中对肌肉发育起着重要的调控作用,并且自身也受到外源性甲状腺激素和硫脲的调控。