论文部分内容阅读
骨肉瘤(osteosarcoma)是儿童和青少年最常见的起源于间充质细胞的恶性骨肿瘤。随着骨肉瘤治疗手段的进展,如扩大切除术、放疗和新辅助化疗,其5年生存率已经增加到50～60%。以铂类为基础的药物,例如顺铂,是骨肉瘤化疗常用的有效的药物。环氧化酶(cyclooxygenase,COX)是催化花生四烯酸合成前列腺素(PG)的限速酶。研究表明,COX至少有两种同工酶,结构型COX即COX-1基因定位于染色体9q32～33.3,在各种组织细胞中稳定表达;诱导型COX即COX-2基因定位于染色体1q25.2～25.3,是一种诱导性即刻反应基因,在正常组织中一般没有明显表达;COX-3是COX-1的一种剪接变体,在哺乳动物的大脑皮层有丰富的表达。研究发现COX-2.高表达存在潜在的致瘤性,并且与肿瘤的发生发展及其生物学行为密切相关。非甾体类抗炎药(NSAIDs)是COX的抑制剂,能够诱导细胞凋亡和促进化疗药物的细胞毒作用。选择性COX-2抑制剂Celecoxib是近年来开发的新型非甾体类抗炎药,其特点是选择性作用于COX-2,对COX-1的活性几乎没有抑制作用。尽管Celecoxib精确的机制尚不明确,然而它的抑制细胞增殖和诱导凋亡是众所周知的,这在结直肠肿瘤和家族性腺瘤性息肉病中已经得到了证实。在本实验中,我们研究Celecoxib和/或Cisplatin诱导骨肉瘤MG-63细胞的凋亡现象,并探讨其机制。我们研究发现,MG-63细胞经过Celecoxib(50,100μmol/L)和/或Cisplatin(10μg/ml)处理48h后,细胞增殖抑制实验(MTT)证实Celecoxib和Cisplatin均能够抑制MG-63细胞的增殖,并且Celecoxib呈现剂量依赖效应。Celecoxib联合Cisplatin对MG-63细胞的生长具有协同抑制作用。倒置显微镜观察药物干预后的MG-63细胞,发现细胞体积变小、皱缩、变圆、脱落。电镜检测发现药物作用后细胞变圆收缩,染色质凝集成半月形附于核膜,核裂解并可见凋亡小体。在Celecoxib(100μmol/L)和Cisplatin(10μg/ml)联合作用于MG-63 48h后可见到特征性的梯形DNA ladder条带。利用流式细胞仪分析药物作用后的MG-63细胞,检测到G1期阻滞和凋亡,并且Celecoxib(100μmol/L)和Cisplatin(10μg/ml)联合的凋亡率明显的高于其他的实验组,这与DNA ladder的结果吻合。Celecoxib为选择性的COX-2抑制剂,其诱导凋亡可分为COX-2和非COX-2途径。在我们的实验中,我们通过RT-PCR和Western blot证实Celecoxib联合Cisplatin作用于骨肉瘤细胞MG-63并没有发现COX-2表达的下调。研究发现,Celecoxib联合Cisplatin明显的降低了PI3K/Akt、survivin、bcl-2的表达,更为重要的是检测到了procaspase-9,procaspase-3和PARP的裂解片段。因此,Celecoxib通过非COX-2途径诱导MG-63的凋亡,可能与PI3K/Akt、survivin、bcl-2相关。为了证实PI3K/Akt途径在西乐葆抗肿瘤中的作用,我们使用特异性的PI3K抑制剂wortmannin(1μmol/L)作用于MG-63细胞48h,检测到pAkt(Thr308),bcl-2,survivin表达的下调,这证实西乐葆诱导肿瘤凋亡作用是通过PI3K/Akt途径。因此,PI3K/Akt途径在survivin、bcl-2表达调控中发挥重要作用,可能是Celecoxib药物干预的中心环节。