尽管乳酸菌的分类是基于它们厌氧或者微好氧条件下代谢葡萄糖产生乳酸的能力,许多乳酸菌都可以在有氧条件下生长代谢并利用乳酸。乳酸杆菌(Lactobacillus)属于典型的乳酸菌,由于其风味特性、益生特性、产生抗菌物质的能力及发酵过程中的易用性,常被用于发酵食品、青贮饲料和益生菌制剂的生产中。乳酸杆菌在有氧条件下的生理代谢各不相同,如何充分利用有氧生长获取高密度的菌体细胞并通过降低氧胁迫保持较高的细胞活性,对于其在实际生产中的应用具有重要的意义。枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)作为一种益生菌广泛应用于畜禽及水产养殖业,在动物日粮中添加Bsubtilis可以明显增加胃肠道和粪便中乳杆菌的数量,但其机理还没有得到充分解释。因此,本文以植物乳杆菌(Lb. plantarum)、短小乳杆菌(Lb. brevis)为对象,对其有氧代谢进行了研究,同时以Bsubtilis168为对象,基于乳杆菌的有氧代谢对其益生作用机制进行探讨,另外还对乳杆菌与B. subtilis(?)混合型微生态制剂的工艺创新进行了初步探索,具体结果如下1. Lb. plantarum的发酵、有氧代谢与氧胁迫Lb. plantarum是一种广泛应用于发酵食品、青贮饲料和益生菌制剂的菌株。本文研究了Lb. plantarum LA1在MRS(0.5%葡萄糖)培养基中、以下四种条件下①厌氧条件(静止培养)②有氧条件(摇动培养)③有氧呼吸条件(摇动培养+外源血红素和维生素K2,即将其电子传递链补充完整)④过氧化氢酶保护条件(摇动培养+外源血红素,即激活其自身过氧化氢酶)下的代谢特性,包括：①生物量(OD600)②细胞活力(CFU/mL)③葡萄糖代谢产物(乳酸、乙酸、乙醇)④氧胁迫(培养基中H2O2含量)。氧气参与Lb. plantarum LA1的代谢时对其具有明显的两面性。有氧代谢可使其最高菌体密度从3.5提高至5.0左右,但同时会产生高达3-4mM的H2O2,因此达到生长峰值后细胞因严重的氧胁迫迅速开始死亡,24小时以后几乎不能检测到活菌。Lb. plantarum发酵葡萄糖的终产物主要是乳酸,而在有氧条件下转变为乳酸和大量乙酸的混合物,并且在添加血红素激活其自身过氧化氢酶后,高活力细胞可将乳酸完全转化为乙酸,同时产生额外ATP而获得更高生物量。目前关于Lb.plantarum有氧呼吸的研究并不充分,本文的结果说明,有氧呼吸可以进一步促进Lb. plantarum的有氧代谢,但对生物量的提高作用并不明显,与其它有氧条件并无显著差异。2. Lb. brevis的发酵与有氧代谢研究Lb. brevis作为一种重要的发酵剂,常用于切达干酪的生产,在干酪的成熟中起着重要作用。本文研究了Lb. brevis ATCC367在上述四种条件下的代谢特性氧气参与Lb. brevi.s的代谢时对其具有显著的益处,既使其生物量从15提高至4.1(摇动条件)甚至55(有氧呼吸),又检测不到H2O2的积累,因此可保持较高的细胞活力Lb. brevis发酵葡萄糖的终产物主要是乳酸,同时伴有C02和少量乙醇的生成,而在有氧条件下转变为乳酸和大量乙酸的混合物,并最终将乳酸完全转化为乙酸,同时产生额外ATP而获得更高生物量Lb. brevis的有氧呼吸未见报道,本文的结果说明,有氧呼吸可以显著促进Lb. brevis的有氧代谢,使其比其他三种条件下具有更迅速的代谢转化和更高的生物量3. Lb. brevis有氧代谢时乳酸向乙酸的转化途径在Lb. planiarum和Lb. brevis(?)勺有氧代谢中均存在乳酸向乙酸的转化。目前对Lbplantarum的这一转化途径研究比较清楚,即乳酸氧化酶、丙酮酸氧化酶和乙酸激酶途径,并由丙酮酸氧化酶产生对细胞有毒性的H2O2。但Lb. brevis在乙酸生成中并无H2O2积累,其具体途径未见报道本研究通过单交换法构建了Lb. brevis ATCC367的丙酮酸脱氢酶缺陷株Lb. brevis ATCC367-pdh和丙酮酸氧化酶缺陷株Lb. brevis ATCC367-pox,其发酵代谢与野生型并无明显差异。但是在有氧代谢时,丙酮酸脱氢酶缺陷株的生物量较野生型出现大幅下降,终产物中乳酸增加、乙酸减少,且无乳酸向乙酸的转化。丙酮酸氧化酶缺陷株的有氧代谢与野生型无异。由此证明了丙酮酸脱氢酶在Lb. brevis有氧代谢中的主导作用。另外,real time RT-PCR显示,在摇动条件下尤其是葡萄糖耗尽时丙酮酸脱氢酶基因pdh和丙酮酸氧化酶基因pox的表达出现显著上调,证明了氧气对二者的正调控和葡萄糖对二者的负调控作用。由此,本文阐明了Lb. brevis在有氧代谢时伴随额外ATP产生的乳酸乙酸转化途径,从而为其高密度发酵和抗氧胁迫提供了理论依据。4. B. subtilis协助乳杆菌对抗氧胁迫B. subtilis作为一种益生菌广泛应用于畜禽及水产养殖业,传统观点认为其通过“生物夺氧”机制为肠道中另一种益生菌——乳酸杆菌创造有利环境而促进其生长。但是肠道中动态变化的氧气水平不可避免会地影响乳杆菌的代谢,且些乳杆菌可在利用氧气获得更高生物量的同时产生细胞毒性的H2O2。本文检测了B. subtilis在人工肠液中的自裂解现象,并通过HPLC检测验证了其裂解液中含有血红素。将B. subtilis168与Lb. plantarum LA1进行体外摇动混合培养2天后,Lb. plantarum的细胞存活力较单独通氧培养提高了109倍；或将B. subtilis的裂解液添加到培养基中,Lb. plantarum自身过氧化氢酶被激活,可维持较高细胞存活力、较高DNA完整度,且培养物中无H202积累。因此,乳杆菌可得益(?)B. subtilis(?)菌产生的过氧化氢酶和裂解后产生的血红素,从而对抗氧胁迫。本研究刘B. subtilis(?)有的益生作用机理进行了进一步补充。5.乳杆菌与B. subtilis混合型微生态制剂工艺创新初探液态混合型微生态制剂的传统生产方法是将乳杆菌和B. subtilis分别培养后再混合。一些乳杆菌在通氧培养条件下可获得更高的生物量,但同时会因遭受氧胁迫(如H2O2)而降低细胞存活力；B. subtilis是一种好氧菌,对抗氧胁迫的机制较为完善,它可产产生乳杆菌不具有的血.红素和过氧化氢酶。因此二者的混合培养具有许多优势。为在终培养物中达到高菌体蛋白、高乳杆菌活菌数和高芽孢数,本文通过对接种状态、接种量和接种比例进行优化,确定了在MRS(05%葡萄糖)培养基中,较优的混合培养条件：对于b. casei BL23和B. subtilis168,接种量为1.5%+10%,发酵时间为24小时；对于Lb. plantarum LA1和B. subtilis168,接种量为1%+10%,发酵时间为18小时。对于混合培养在实际工业生产中的应用,尚有许多优化空间。由此,本文对乳杆菌与B. subtilis混合型微生态制剂的生产工艺进行了创新,从而为降低生产成本提供了可能性。