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前言:马兜铃酸(aristolochic acid, AA)为马兜铃属植物的主要成分,是植物界发现的第一个含硝基的有机物。马兜铃属(Aristolochia)植物广泛分布于热带和亚热带地区,全世界有200多种,我国约有40种以上。该属植物药用价值自古以来就为人所知,被广泛用于治疗各种感染症、皮肤病、肿瘤、水肿,咳嗽和关节痛等。但自1993年比利时的学者Vanherweghen等首次报道含有AA的中草药引起进行性间质性肾纤维化最终导致肾衰以后,其他国家也相继发现含AA的中草药对动物和人具有致癌性。一时间世界各国对含有或怀疑含有AA的中草药引起了广泛的关注。20世纪80年代初,体外实验和动物实验结果表明,AA具有较强的致突变和致癌作用。根据人群资料和动物实验资料,2002年国际癌症研究中心(IARC)将含马兜铃属植物的中草药列为对人的第一类致癌物。据报道,鼠伤寒沙门氏菌(Salomonella typhimurium)回复突变试验结果表明,AA对TA100、TA1537、TA102菌株是直接致突变物。果蝇试验结果表明,AA能引起伴隐性致死(SLRL)、精细胞染色体缺失、幼虫体细胞基因重排。在体外培养哺乳动物细胞中AA能造成6-硫鸟嘌呤抗性突变、姐妹染色单体互换(SCE)、染色体畸变等结果阳性。AA还可造成CHO细胞、小鼠骨髓瘤细胞、猪上皮细胞、人淋巴细胞和HepG2细胞的DNA损伤,从而导致遗传毒性。目前对其机制研究表明,AA的遗传毒性及致癌性可能与AA与DNA形成加合物有关。活性氮(Reactive Nitrogen Species, RNS)包括一氧化氮(NO)及其同系物如过氧亚硝基阴离子(ONOO-)等对DNA造成损伤从而导致炎症、遗传毒性和致癌性的研究越来越引起人们的重视。受此启发,我们对RNS是否也参与AA引起HepG2细胞的DNA损伤,从而导致遗传毒性进行了进一步的探讨。本研究选用的HepG2细胞是来源于人类的肝癌细胞系,它保存了较完整的生物转化代谢酶的活性,是检测外来化合物遗传毒性的理想细胞系。通过此试验系统对AA引起的遗传毒性以及活性氮对DNA造成的损伤进行研究,进一步为揭示AA的遗传毒性和致癌性提供实验依据。方法:以HepG2细胞作为试验系统。噻唑蓝(MTT)比色法检测AA的细胞毒性。单细胞凝胶电泳(SCGE)试验检测AA对DNA造成的损伤。微核(MN)试验检测细胞染色体损伤的情况。2,3-二氨基萘(DAN)法测定细胞内亚硝酸盐水平,从而间接的反映细胞内NO的生成情况。免疫组化方法检测细胞内8-OHdG的表达情况,间接的反映细胞内ONOO-的生成情况。结果:AA对HepG2细胞的生长抑制率随着其浓度的增加而增加,接触24和48 h的半数抑制浓度(IC50)分别为132.24和62.2μM。HepG2细胞接触25-200μM ?的AA 1 h后,DNA断裂形成的彗星样的拖尾、尾DNA含量及尾矩明显增大,呈剂量依赖关系,提示DNA链发生明显断裂,且随着AA浓度的增高断裂程度逐渐增加。HepG2细胞与12.5-50μM的AA接触24 h后,细胞微核率明显高于未用AA处理的细胞,且存在剂量依赖关系。细胞接触50-200μM ?的AA 1 h后,可引起细胞内亚硝酸盐的水平明显增加。50-200μM的AA作用HepG2细胞3 h后,导致8-OHdG的表达明显升高。结论:AA对HepG2细胞具有细胞毒性,通过彗星试验和微核试验表明AA能引起HepG2细胞DNA链的断裂和染色体的损伤。较高浓度的AA可诱发HepG2细胞内NO水平和8-OHdG的表达明显升高。以上结果提示AA对HepG2细胞具有遗传毒性可能与NO及其同系物ONOO-等RNS所引起的DNA损伤有关。