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随着基因工程的发展,利用植物作为生物反应器生产外源蛋白的研究因其广阔的商业前景在世界范围内受到广泛的重视。植物RNA病毒载体表达体系是利用植物生产外源蛋白的一个新兴的、极具潜力的平台。但是,在长期的植物病毒和寄主互相过程中,寄主植物进化产生的多种针对植物RNA病毒的抗病机制,会严重地影响病毒载体介导的外源基因的表达水平。本研究以核孔运输原理为依据,用Assembly PCR技术合成拟南芥U6-1基因,并构建RNA聚合酶Ⅱ介导转录的U6RNA瞬时植物表达载体。以农杆菌渗滤法与烟草花叶病毒(TMV)病毒表达载体共接种烟草,通过比较分析接种烟草中报道基因GFP的表达变化规律,研究了非编小RNA-U6对TMV病毒表达载体作用效果。实验结果如下：1.利用Assembly PCR技术,通过设计的三对引物(两对合成引物和一对筛选引物),经过组装和筛选2步PCR反应,在体外合成了拟南芥U6-1基因序列；并通过亚克隆技术构建了Ⅱ型启动子介导的U6RNA植物瞬时表达载体pBIN19U6。2.利用农杆菌渗滤技术将U6RNA植物瞬时表达载体pBIN19U6与TMV病毒表达载体pJL TRBO-G共接种寄主植物本氏烟。结果表明,在适宜的TMV病毒表达载体接种浓度下(OD600=0.008),共表达U6ncRNA对TMV病毒表达载体表达外源基因的水平有着明显的增效作用。3.病程相关蛋白(Pathogenesis-related proteins,PR) PR2的、Western blots检测结果表明,共表达U6ncRNA可以有效的抑制PR2蛋白质的表达水平。证明Ⅱ型启动子介导转录的U6RNA竞争性地影响核孔运输,从而抑制宿主防御性相关RNA从核孔的输出,进而提高植物病毒表达载体侵染的成功率,最终获得外源基因的高效表达。4.共接种U6ncRNA后外源基因表达的时间变化规律研究表明,U6ncRNA对提高病毒载体介导的外源基因表达水平的作用仅在接种前期(接种后2-5天)比较明显,推测U6ncRNA的增效具有时间效应。5.与黄瓜花叶病毒(CMV)编码基因沉默抑制子2b蛋白的比对研究表明,其提高载体表达水平的能力与病毒编码的基因沉默抑制子相当。