研究背景和目的鼻咽癌（Nasopharyngeal carcinoma）是发生于鼻咽粘膜上的恶性肿瘤,其发生是一个多阶段、多途径、多机制的过程。该疾病主要高发于我国南方省份、香港、台湾及东南亚一些国家和地区,具有明显的种族聚集性和地域性。 EBV感染、各种环境因素共同累积、遗传易感性及表观遗传学的改变最终导致了一些关键性的癌基因过表达及抑癌基因表达下调或缺失表达等,导致鼻咽粘膜产生病理性变化,在经过癌前病变后最终发生鼻咽癌并不断进展,最后由于肿瘤细胞发生转移而导致患者死亡。由于鼻咽癌发生非常复杂,涉及了多因素参与、多基因异常表达调控,多信号途径改变等,因此,完全弄清楚其具体发病的机理一直是一个亟待解决的难题,也成为了防治鼻咽癌和改善鼻咽癌预后的中心问题,需要众多学者们不断努力的探索和解决。原NESG1基因（Genbank AF094758）,官方名字叫CCDC19（NM₀12337.1）,是由本实验室姚院士指导的黎仲奎博士生在1999年利用mRNA差异显示法并结合3’-RACE和5’-RACE技术,扩增出来的长约1.4kb和0.7kb的片段（其中包含了一段174bp的重叠产物以确认扩增的特异性）,拼接后发现了一个连续的全长大约1850bp cDNA片段（由于当时人类基因组序列还没有公布以及测序技术水平的局限性,对于新克隆的序列完全正确与否很难判断）。进一步分析发现,NESG1基因位于1q22,预测编码框长1161bp,编码386个氨基酸,分子量为46252Da,蛋白质等电点为9.99,通过PSORT Ⅱ和SOSUI网上预测,发现它是可溶性核蛋白。BLAST比对发现,NESG1的cDNA序列与婴儿肺组织cDNA文库和Stratagene肺癌cDNA文库中的两个EST序列同源。通过对多种组织（包括鼻咽粘膜、食管、气管、膀胱、肝脏、大脑、心脏、肺脏、胸腺、肾脏、胃和大肠）进行Northern杂交显示,发现该基因特异性的表达于鼻咽和气管纤毛柱状上皮。在原NESG1基因克隆后,本课题组曾尝试着研究其功能,但一直未有进展。2005年下半年,我们对该基因原编码区重新进行了克隆并测序分析时发现,测序结果与原提呈的AF094758（NM₀12337.1）序列存在两处差异：CDS区第1181碱基由A替代了G,第905位点处由A碱基填补了原来的缺失突变,从而导致氨基酸编码框改变。新序列与人类基因组序列比对分析显示了完全的一致性。由于新序列1181碱基由A替代了G以及905位点A碱基的插入,导致NESG1基因的编码序列较前发生了变化。编码框重新预测,结果显示NESGl基因全长为1656bp,编码551个氨基酸。这与食蟹猴睾丸CDNA中克隆出的NESG1基因（AB168450）的编码框预测长度结果一致。向NCBI参考序列部提交修改申请后,Genbank数据库接收了修改意见,使其版本由最初的NM₀12337.1升级为NM₀12337.2。随后本课题组刘真博士对新校正抑癌候选基因NESG1在鼻咽癌中功能及分子机制进行了进一步的研究,发现NESG1基因极有可能在鼻咽癌中发挥抑癌基因的角色,介导了重要的抑制性信号转导通路。尽管NESG1与鼻咽癌发生发展的关系已经明确,但是NESG1参与的信号通路并不清楚。因此本研究我们选定NESG1基因的相互作用蛋白为研究对象,通过大量实验明确证实与NESG1相互作用的蛋白,重点探讨NESG1相互作用蛋白对鼻咽癌增殖、转移和侵袭的影响和作用机制,阐明NESG1相互作用蛋白在鼻咽癌发生发展中的生物学功能及其分子机制。最终希望能够揭示NESG1参与的信号通路,从而阐明NESG1蛋白及其相关的信号通路在鼻咽癌发生发展中的作用,并为鼻咽癌的早期诊断和治疗提供理论基础。方法：1.NESG1相互作用蛋白的预测与筛选（1）NESG1相互作用蛋白的生物信息学预测首先利用在线分析软件和数据库对NESG1可能的相互作用蛋白进行生物信息学预测,然后对NESG1及其可能的相互作用蛋白的进行分析。（2）酵母双杂交筛选NESG1相互作用蛋白克隆人NESGI基因CDS序列,构建pGBKT7-NESG1酵母表达载体,以NESG1蛋白为“诱饵蛋白”,筛选人正常组织CDNA文库,寻找NESG1相互作用蛋白。2.NESG,1相互作用蛋白的验证及其生物信息学分析运用基于蛋白质水平的免疫共沉淀和共定位分析等技术对酵母双杂交系统初步筛选的结果进行验证。（1）免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitat ion）分别构建带有MYC和HA蛋白表达标签的NESG1和VPS33B的真核表达载体,两种载体共转染HEK293A细胞,通过protein A/G-beads+Anti-MYC和protein A/G-beads+Anti-HA分别进行免疫复合物共沉淀,再以抗HA和抗MYC的抗体行Western blot检测，确定外源性的NESG1和VPS33B是否存在相互作用。（2）共定位分析构建真核表达载体PCMV-HA-VPS33B和PCMV-MYC-NESG1,将两种载体共转染HEK293A细胞。转染48h后,利用不同种属来源的抗MYC和抗HA抗体进行免疫荧光双标记,分别在正置荧光显微镜下观察外源性的NESG1和VPS33B在细胞体内是否存在共定位现象。（3）VPS33B的生物信息学分析利用在线分析软件和数据库对VPS33B蛋白的结构特点、表达特征及其可能的相互作用蛋白网络进行生物信息学的初步分析预测。3.VPS33B基因在鼻咽癌组织中的表达检测及其临床意义分析应用荧光定量PCR和免疫组化技术从mRNA和蛋白水平检测VPS33B在鼻咽癌组织和非鼻咽癌组织的表达,初步探讨VPS33B与鼻咽癌发生发展的关系。4.VPS33B基因在鼻咽癌中功能与分子机制的初步研究克隆人VPS33B基因CDS序列,构建含VPS33B的CDS慢病毒载体,将慢病毒载体质粒与辅助质粒共转染293FT细胞包装慢病毒,收集病毒上清,进行病毒滴度测定。用含VPS33B基因的慢病毒感染鼻咽癌细胞系5-8F和HONE-1,空载体的病毒作为阴性对照。流式细胞仪分选出GFP+细胞,Western blot检测各细胞株中VPS33B基因表达情况,以此做为下一步实验的研究对象。利用MTT法、平板克隆形成实验及流式细胞术检测VPS33B基因过表达后对细胞体外增殖的影响；利用Boyden小室进行体外侵袭实验,检测VPS33B基因过表达后对鼻咽癌癌侵袭能力的影响；在裸鼠体内观察VPS33B基因过表达后对鼻咽癌细胞致瘤能力的影响。利用Western blot检测VPS33B基因导入前后,与细胞周期进展相关的一些重要蛋白及其它重要信号通路蛋白的表达情况,初步探讨VPS33B基因抑制鼻咽癌发生发展的分子机制.化学合成靶向VPS33B的siRNA干扰片段,瞬时干扰过表达VPS33B基因的鼻咽癌细胞,荧光定量PCR和Western blot检测各干扰细胞中VPS33B基因干扰效率,以干扰效率最高的片段为下一步实验的研究对象。以通用型阴性片段作为阴性对照,利用MTT法、流式细胞术及Boyden小室侵袭实验等观察VPS33B表达抑制后细胞生长及侵袭能力的变化,进一步探讨VPS33B基因在鼻咽癌细胞中的基本功能。本课题所采用统计方法：采用GraphPad Prism5和SPSS16.0统计软件进行统计学处理和分析,计量资料用x±s表示。免疫组化组间的比较采用卡方检验,荧光定量比较鼻咽癌组织与非癌鼻咽组织样本之间VPS33B的表达水平用两独立样本t检验,如方差不齐,采用Welch值；细胞体外生长实验采用析因设计的方差分析；平板克隆形成实验、细胞周期检测、侵袭实验和裸鼠皮下成瘤实验采用独立样本t检验,如方差不齐,采用Welch值,组间的多重比较采用LSD检验。以P<0.05为差异有统计学意义。结果：1.NESG1相互作用蛋白的预测与筛选（1）NESG1相互作用蛋白的生物信息学分析利用在线数据库,发现人NESG1与果蝇CG11449-PA同源,进而发现果蝇CG11449-PA蛋白是GG1135-PA、CG1487-PA等15个蛋白间的重要交汇点。应用保守的蛋白间相互作用方法,初步预测人UBR4、ARRB1等6个蛋白为NESG1相互作用蛋白。（2）酵母双杂交筛选NESG1相互作用蛋白以NESG1蛋白为“诱饵蛋白”,筛选人正常组织CDNA文库,共获得九个与NESG1诱饵蛋白相互作用的阳性克隆,经过测序证实均为ENKUR、CCDC65、VPS33B、 RNF2、NUP155、TEX2、ZRANB1、SPATA22、GOSR1。2.NESG1相互作用蛋白的验证及其生物信息学分析（1）免疫共沉淀免疫共沉淀结果显示protein A/G-beads+Anti-MYC沉淀MYC-NESG1蛋白的同时,HA-VPS33B也一同被沉淀。而用protein A/G-beads+Anti-HA沉淀HA-VPS33B蛋白的同时,外源蛋白MYC-NESG1也一同被沉淀,实验说明外源性的NESG1和VPS33B在体内环境中存在相互作用关系。（2）共定位分析共转染外源性NESG1和VPS33B的表达,正置荧光显微镜下观察到的实验结果证实NESG1与VPS33B两种蛋白在细胞内确切存在相互作用。酵母双杂交的初步筛选,免疫共沉淀和共定位分析验证方法的实验结果最终明确证实NESG1蛋白与VPS33B蛋白之间存在直接相互作用。（3）VPS3B的生物信息学分析根据VPS33B的序列特征,初步证实VPS33B属于Sec-1结构域家族的一员。虚拟Northern杂交的结果发现VPS33B在在甲状腺和肺癌中表达较低。利用生物信息学对VPS33B相互作用蛋白的初步分析发现Ras癌基因家族成员RAB11A蛋白可能与VPS33B存在相互作用关系。3.VPS33B基因在鼻咽癌中的表达检测及其临床意义分析荧光定量PCR的检测结果发现VPS33B mRNA在鼻咽癌组织和非鼻咽癌组织的表达明显不同,差异具有显著性（t=-2.412，P=0.029）。免疫组化结果显示,VPS33B表达主要定位在细胞胞浆内,在鼻咽癌组织和非鼻咽癌组织的表达明显不同,差异具有显著性（x2=18.721,p<0.001）,结果与mRNA水平的检测结果具有一致性。VPS33B蛋白的表达与鼻咽癌患者的临床分期密切相关,临床分期越早,VPS33B表达越强；而临床分期越晚,VPS33B表达越弱或阴性。4.VPS33B基因在鼻咽癌中功能与分子机制的初步研究（1）利用慢病毒建立了稳定表达外源性VPS33B基因的鼻咽癌细胞株构建含有VPS33B的CDS慢病毒载体,包装慢病毒后,含VPS33B基因的慢病毒感染5-8F和HONE-1细胞株,流式细胞仪分选出GFP+细胞,建立了稳定表达外源性VPS33B的细胞株,Western blot技术检测各细胞的VPS33B的表达情况,做为下一步实验的研究对象。（2）VPS33B过表达在鼻咽癌中功能与分子机制的初步研究MTT法观察VPS33B基因过表达后体外细胞的增殖情况,与5-8F-NC和HONE-1-NC细胞相比,5-8F-VPS33B和HONE-1-VPS33B细胞的增殖速度明显减慢,并且呈时间依赖关系（5-8F:F=134.393,P<0.001:HONE.1:F:134.761,P<0.001）；平板克隆形成实验显示5-8F-VPS33B和HONE-1-VPS33B细胞的活力显著下降（5-8F:t=6.037,P=0.004；HONE-1:t=7.846,P:=0.001）；利用流式细胞术检测各组细胞的细胞周期的结果显示5-8F-VPS33B和HONE-1-VPS33B细胞G1期比率增多,S期比率减少,表明VPS33B过表达后细胞增殖缓慢（5-8F:t=5.695,P=0.005； HONE-1:t=054,P=0.015）；综合结果表明VPS33B表达水平升高后,肿瘤细胞体外生长被显著抑制。体外侵袭小室实验检测VPS33B基因过表达后细胞侵袭能力的改变,结果显示,与5-8F-NC’和HONE-1-NC细胞相比，5-8F-VPS33B和HONE-1-VPS33B细胞侵袭能力无显著变化（5-8F-VPS33B:t=0.263, P=0.805; HONE-1-VPS33B: t=0.697, P=0.524;均P>0.05）,说明VPS33B过表达后并没有抑制鼻咽癌细胞的体外侵袭能力。将VPS33B基因过表达的鼻咽癌细胞和对照细胞接种于裸鼠的皮下,通过2-3周连续的观察,我们发现VPS33B基因过表达后,显著性地抑制了鼻咽癌细胞的体内增殖能力。与5-8F-NC和HONE-1-NC细胞相比,5-8F-VPS33B和HONE-1-VPS33B细胞皮下成瘤重量（5-8F:t=5.695, P=0.005; HONE-1:t=6.520,P=0.003）和体积（5-8F:t=5.119, P=0.007; HONE-1:t=10.536, P<0.001）的生长速度显著减慢。运用Western blot技术检测VPS33B基因导入后与细胞周期相关的几个重要基因的表达,发现c-myc, CDK4, CCND1, CCDE1, p-Rb and E2F1表达下调,P16表达上调,而总的Rb表达不变。同时检测了PTEN, p-AKT, AKT, p-PI3K and PI3K的表达,发现PTEN, AKT and PI3K表达不变,p-AKT and p-PI3K的表达下调。最后我们检测了与EMT相关的几个重要调控因子的变化情况,发现E-cadherin、 N-cadherin和Vimentin表达不变。（3）抑制VPS33B表达对鼻咽癌细胞的生物学功能影响利用阳离子脂质体将化学合成siRNA转染至鼻咽癌细胞5-8F-VPS33B和HONE-1-VPS33B,荧光定量PCR和western blot检测沉默效果,结果显示,设计合成的3对siRNA序列中,03号干扰效果最佳,以其作为后续功能研究。采用MTT法观察对VPS33B基因沉默后5-8F-VPS33B和HONE-1-VPS33B细胞体外增殖能力变化,与5-8F/VPS33B/NC和HONE-1/VPS33B/NC细胞相比,5-8F/VPS33B/si-VPS33B和HONE-1/VPS33B/si-VPS33B细胞的增殖速度明显加快（5-8F：F=56.419,P<0.001; HONE-1:F=51.638, P＜0.001）.结论：1.NESG1蛋白与VPS33B蛋白在体内存在直接相互作用,NESG1-VPS33B相关信号途径参与了鼻咽癌的发生发展。2.VPS33B与鼻咽癌发生发展密切相关,是促进鼻咽癌增殖的重要基因。本研究的创新之处1.利用酵母双杂交系统结合基于蛋白质水平的免疫共沉淀和共定位分析方法,筛选并鉴定出鼻咽癌相关基因NESG1的新型相互作用蛋白VPS33B,提出NESG1-VPS33B相关信号途径参与鼻咽癌发生发展的设想,为研究鼻咽癌的信号通路机制提供新的思路；2.利用慢病毒载体建立了稳定的过表达VPS33B基因的鼻咽癌细胞株,为进一步阐明NESG1-VPS33B相关信号途径调节结鼻咽癌发生发展的机制提供新的实验手段；3.初步证实VPS33B与鼻咽癌的增殖密切相关,而与转移无关。