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研究背景急性髓细胞性白血病(acute myeloid leukemia, AML)是最常见的急性白血病(acute leukemia,AL)。虽然大多数AML患者在标准诱导化疗后达到完全缓解(complete remission, CR),但多数患者缓解后会复发和死亡。尤其是年龄大于60岁的AML患者患者的预后更差,目前认为白血病复发的根源在于白血病干细胞(leukemia stem cell, LSC),主要是因为传统的化疗方案不能充分地杀伤LSC。流式细胞术(Flow cytometry, FCM)检测白血病细胞的免疫表型(immunophenotyping, IP)是一种能够快速诊断和识别AML复发非常有用的技术,同时复发的现象也反映了目前针对LSC治疗的失败。多参数流式细胞仪通过识别抗原异常的表达模式,在检测白血病微小残留病(minimal residual disease, MRD)上有更大的敏感性,能够早期预测疾病的复发。虽然AML细胞所表达的细胞表面抗原和正常造血细胞上表达的抗原是相同的,但恶性髓系细胞的细胞表面抗原的表达的模式是异常的。另一方面,在缺乏白血病的特异性标记物的情况下,FCM在鉴别白血病细胞和正常的干/祖细胞上主要依赖抗原组合,即白血病相关的免疫表型(leukemia-associated immunophenotyping, LAIP),其在正常骨髓中(normal bone marrow, NBM)不表达或很少表达。但由于LAIP在患者之间有很大的不同,疾病过程中也是不稳定的,故仍需要识别新的稳定抗原来补充抗体组合,提供诊断和预后信息,尽早识别复发,提高AML的诊断符合率和MRD的检出率。研究发现,C-型凝集素样分子1(C-Type Lectin-Like Molecule-1, CLL-1),存在于外周血和骨髓的髓系细胞和大部分AML白血病细胞,同时也表达于AML大部分的CD34+CD38-干细胞上,而在正常人CD34+CD38-干细胞上不表达。白血病细胞表面抗原CLL-1的表达有助于区分髓系白血病与淋巴系列白血病。CLL-1作为LSC的标志抗原,有助于正常干细胞和白血病干细胞之间的鉴别和分离,在白血病免疫分型诊断和AML的MRD检测上有重要的价值。提高AML的疗效还需要探索更好的治疗方法。用单克隆抗体清除白血病细胞,是AML治疗的一个潜在的方向。进一步研究CLL-1在正常骨髓和AML中的表达情况也对CLL-1的单克隆抗体在AML的靶向治疗上有重要意义。目前,CLL-1在国内AML患者的表达情况尚缺乏数据。显然,解决临床上AML问题,需要进一步研究患者的临床指标,分子生物学,细胞遗传学和免疫分型资料。CLL-1在AML中的临床意义需要更多的数据支持。目的结合AML患者的临床病理资料,从实验数据的基础上研究CLL-1在AML细胞的表达模式,并揭示CLL-1在白血病干细胞和正常干细胞之间的区别,为CLL-1用于区分髓系白血病和MRD检测提供实验和理论依据。对象与方法1.BM和PB标本来自于64例新诊断、未经治疗的AML患者(成人53例和儿童11例),19例骨髓增生异常综合征患者,23例急性淋巴细胞白血病(acute lymphoblastic leukemia, ALL)患者(包括15例B-ALL、8例T-ALL),1例T-B混合表型急性白血病(mixed phenotype acute leukemia, MPAL)、1例不能分类急性白血病和1例急性未分化白血病(acute undifferentiated leukemia,AUL)患者进行了分析。AML是根据法国,美,英(FAB)分类标准分类。此外,对6例患者中的BM样本进行MRD状态评估和CLL-1的表达变化检测。8例正常骨髓(NBM)来自于健康志愿者,6例动员后外周血(mobilized peripheral blood, MPB)由健康供者经过粒-细胞集落刺激因子(G-CSF)动员后获得。诊断根据回顾性分析患者的血常规,形态学,免疫组化,免疫学,细胞遗传学和分子遗传学资料。所有的采样,均获得当地的伦理委员会的批准,患者的知情和同意。2.每例患者取骨髓血或外周血2-4m1,行相应抗体标记,采用流式细胞仪进行免疫表型分析。单克隆抗体主要包括：CD34-APC, CD38-V450, CLL-1-PE, CD45-V500, CD19-PC7。3.运用标准多参数流式细胞术(FCM)来研究CLL-1在所有收集的诊断样本的表达情况。数据采集用Canto Ⅱ (BD Biosciences公司,BD)流式细胞仪,数据分析用BD FACSDiva软件。每个组合补偿设定用未标记的空白对照,单个标记和和混合抗体,通过FACSDiva软件计算补偿。PMT增益基线用未标记管来设置。每天运行七色设置微球,测试激光和补偿的稳定性。4.FCM分析以FSC/SSC设门去除死细胞和碎片,每管最低获取20万个CD45阳性细胞,每个管均加入CD45,在低表达CD45和低SSC(CD451ow/SSClow)的基础上圈定CD451ow/SSClow细胞。患者细胞CLL-1染色阳性阳性标准为抗原超过20%的CD451ow/SSClow细胞群,评估的最低有效细胞数是50。抗体表达强度以CLL-1阳性的细胞群的平均荧光强度(MFI)来确定,评估的最低有效细胞数是500。结果1. CLL-1表达在93.2%(60/64)AML病例和89.5%(17/19)的MDS病例中。除1例ALL外,其他ALL病例的CD451ow/SSClow细胞群不表达CLL-1(n=23).2. AML组CLL-1的表达率显著高于MDS组(P<0.001)和NBM组(P=0.001),但三组间MFI比较无明显差异(P=0.15)。3.38.9%(21/54)的AML和42.9%(6/14)MDS患者的CD34+CD38-细胞CLL-1染色阳性,两组间CLL-1表达率(P=0.71)和MFI比较均无差异(P=0.83).CLL-1在NBM组(n=8)和MPB组(n=6) CD34+CD38-细胞中不表达。4.在AML中CD34+组和CD34-组CLL-1阳性率(P=0.30)和MFI值(P>0.05)之间没有显著性差异。5.6例配对的诊断和化疗后样本白血病细胞CLL-1的表达率(P=0.86)和MFI值之间的无差异(P>0.05),表明疾病过程中CLL-1表达的稳定性。结论1.CLL-1可以作为泛髓系白血病相关抗原和白血病干细胞抗原标志,为CLL-1应用于AML的诊断和监控提供了可行性依据。2.CLL-1在AML白血病干细胞中表达,而在正常CD34+CD38-干细胞中不表达,为AML的靶向治疗和LSC的研究提供了新思路。