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肠出血性大肠杆菌(Enterohemorrhagic Escherichia coli,EHEC) O157:H7是一种重要的传染病病原菌。自1975年首次被分离、1982年被确认为致病菌以来的20多年中,世界各地包括中国都有不同规模的暴发流行。EHEC O157:H7感染可致腹泻、出血性结肠炎(hemorrhagic colitis,HC),还可引发溶血性尿毒综合征(hemolytic uremic syndrome,HUS)及血栓性血小板减少紫癜(thrombotic thrombocytopenic purpura,TTP)等严重并发症,严重者可导致死亡。EHEC O157的感染因具有暴发流行趋势、强烈的致病性与致死性和抗生素治疗可加剧病情的危险性等特点,已经成为全球性的公共卫生问题。然而目前对其感染仍缺乏有效的防治方法,研究证明抗生素可促使O157菌释放致死性志贺毒素(Stx),从而使患者并发HUS的危险性增加。病原体和宿主的相互作用是决定感染及发病的关键。EHEC与宿主肠道粘膜上皮细胞的粘附是疾病发展的第一步。介导O157细菌粘附定植的主要结构单元是Ⅲ型分泌系统(type-III secretion system,TTSS)。Ⅲ型分泌蛋白EspA(Esp为E. coli secreted protein缩写)在细菌表面形成针状扩展结构,这种结构是绕过细胞微绒毛和粘膜层必不可少的转移装置,它在细菌和宿主细胞之间架起一座桥梁,多种分泌蛋白及Tir被转移至宿主细胞。效应蛋白的转入促使O157紧密粘附至宿主细胞,引起肌动蛋白重排与聚集,导致宿主细胞发生病理改变,形成A/E(attaching/effacing)损伤。EspA不仅在细菌粘附中发挥关键性的起动作用,也在形成A/E损伤的效应分子传递中起到桥梁作用。因此研究EspA的生物学功能及其在粘附定植中的作用对阐明O157的致病机理,寻找预防、控制和治疗O157感染的手段具有重要意义。基于以上认识,本实验从以下几个方面对肠出血性大肠杆菌O157 EspA生物学功能进行了研究,取得了以下结果:1. O157 EspA的克隆表达。采用PCR法自O157菌基因组扩增编码EspA的约580bp全长基因,T-A克隆后构建原核表达质粒pET-28a(+)-espA,经酶切、测序证实与预期序列完全一致。阳性重组子转化E.coli BL21(DE3)后,IPTG诱导目的蛋白表达率约40%,PAGE电泳初步测