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二化螟Chilo suppressalis(Walker)是水稻上的一种重要害虫,对水稻的产量和质量造成重大损失,主要依靠化学农药进行控制。但长期大量使用化学农药,导致二化螟对其产生抗性,使得防治更加困难,同时对周围生态环境产生严重影响。转Bt基因水稻为二化螟的防治提供了一种新方法。在中国转Bt基因抗虫水稻已于2009年获得生物安全证书,有可能在几年后完成相关的后续评估实现商业化种植。二化螟作为转基因Bt水稻的主要靶标害虫之一,其抗性风险是影响转基因水稻长期田间应用的重要因素之一。因此在其大规模商业化种植之前,开展我国田间二化螟种群对Bt毒素的敏感性调查,可以为今后二化螟对Bt水稻抗性风险评估与抗性监测打下良好的基础,相关结果可以作为评价抗性发展水平的重要依据。本文调查了三种Cry1A毒素对室内敏感种群及五个田间二化螟种群的毒力,同时对二化螟潜在的Bt毒素受体钙粘蛋白(cadherin)进行了基因克隆、多态性分析和mRNA表达检测。相关研究结果总结如下:
⑴Cry1A毒素对二化螟敏感种群及田间种群的毒力。对2011年采自浙江温州(WZ)、江西瑞昌(RC)、安徽和县(HX)、江苏大丰(DF)和湖北荆州(JZ)5地秧田的二化螟种群以及室内敏感品系(CN)进行Cry1A毒素(Cry1Aa、 Cry1Ab、 Cry1Ac)的敏感性测定。结果显示,对敏感品系CN的毒力,Cry1Ab最高,LC50为0.229μg/cm2;其次是Cry1Aa,LC50为0.240μg/cm2;毒力最低为Cry1Ac,LC50为0.277μg/cm2。 Cry1Ab、C巧1Aa和Cry1 Ac对5个田间种群的LC50分别在0.147~0.304、0.152~0.335和0.170~0.351μg/cm2之间。各田间种群对Cry1A毒素的敏感性差异不显著(<2倍),对三种Cry1A毒素的敏感性基本均表现为Cry1 Ab>Cry1 Aa>Cry1 Ac。目前,Bt水稻还未进行商业化种植,二化螟田间种群对Cry1A毒素的敏感水平与室内长期饲养的敏感品系相当,甚至更敏感,Bt水稻的种植可以有效减轻二化螟的为害。但为了确保Bt水稻对靶标害虫的长期有效控制,抗性监测和预防性抗性治理方法的相关基础研究工作必须提前展开。
⑵二化螟田闻种群钙粘蛋白基因的多态性和mRNA表达水平。根据已有的二化螟钙粘蛋白基因CsCAD(GenBank: DQ821523.2)的序列,进行了室内敏感品系和四个田间二化螟种群(除大丰种群外)的钙粘蛋白基因的克隆和序列测定。结果显示:5个种群共15个不同钙粘蛋白基因单克隆间碱基和氨基酸的序列差异均不大,全长5148个碱基中有179个碱基存在多态性,约占总碱基数的3.48%;编码的1715个氨基酸中,有100个氨基酸位点存在多态性,约占氨基酸总数的5.83%。同一种群的3个钙粘蛋白基因间的序列相似性极高,都在99%左右;5个不同种群的每个钙粘蛋白序列与CsCAD比较,相似性均超过99%。存在差异的氨基酸平均分布在钙粘蛋白各结构域内,没有在某结构域集中出现的情况。通过实时定量PCR检测发现,室内敏感品系和四个田间二化螟种群钙粘蛋白基因在mRNA表达水平上有一些差异,但差异不显著。JZ种群的钙粘蛋白表达量最高,为1.292,高于敏感种群CN表达量1,其他3个种群表达量均低于CN,其中RC种群钙粘蛋白的表达量最低,只有0.639,WZ和HX的表达量分别为0.656和0.809。从钙粘蛋白序列多态性和mRNA表达量两方面的结果看出,各种群之间的变异较小。二化螟钙粘蛋白已证实可以结合Bt毒素,但是否为有效的毒素功能受体还需进一步验证。