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肠黏膜屏障可有效地阻挡肠道内微生物及其毒素向肠腔外组织扩散,是机体重要的保护屏障。细胞连接是肠黏膜屏障的重要组成部分,是物质通过细胞旁路转运的限制因素,影响蛋白质等大分子亲水性药物和疫苗的吸收效率。最近研究发现一些病原菌粘附定植后,可分泌毒素特异性地作用于肠黏膜屏障,包括肠上皮细胞的损伤和细胞连接蛋白以及细胞骨架蛋白的破坏。本研究主要分为两大部分：一是通过Caco-2细胞(human colon carcinoma cell)单层模型和小鼠实验,研究吸收促进剂对细胞连接(紧密连接和粘附连接)和细胞旁路的调节,观察吸收促进剂对荧光标记分子和胶原酶的促吸收作用；二是利用Caco-2细胞单层模型和大鼠灌胃实验,观察乳酸杆菌对细胞连接蛋白表达和分布的影响,研究乳酸杆菌对病原菌的粘附抑制能力,揭示乳酸杆菌拮抗病原菌粘附的机理。主要分为以下四个试验：试验一：吸收促进剂对Caco-2细胞连接的影响Caco-2细胞体外培养可分化为肠上皮细胞,结构和生化作用与人肠上皮细胞十分相似,具有微绒毛和紧密连接等,是研究肠上皮细胞功能的理想模型,如药物吸收、肠道屏障、细胞分化等。本试验筛选六种吸收促进剂：EDTA、SDS、胆酸钠、葡萄糖、乙醇和薄荷醇,研究在不同的作用时间和作用浓度下吸收促进剂对Caco-2细胞活性、细胞连接蛋白的表达和分布以及细胞旁路的影响。MTT细胞毒性试验结果显示：与对照组相比,EDTA (2.5mmol/L)、SDS(0.2mmol/L)、胆酸钠(10mmol/L)、葡萄糖(750mmol/L)、乙醇(10%)和薄荷醇(1%)在2h内不影响Caco-2细胞活性。转运试验结果表明六种吸收促进剂对不同分子量大小的细胞旁路荧光标记分子FITC (MW 389.4)、FD70S (MW 70,000)和FD2000S (MW 2,000,000)均具有极显著的促吸收作用(P<0.01)。与对照组相比,在2h内EDTA (2.5mmol/L)极显著地促进了FITC的转运量(P＜0.01); SDS (0.2mmol/L)和薄荷醇(1%)极显著促进了FD20S的吸收(P<0.01)；而葡萄糖(750mmol/L)和薄荷醇(1%)则极显著提高了FD2000S转运量(P<0.01)。同时我们发现,空白对照组中ZO-1、claudin-1、occludin和E-cadherin四种细胞连接蛋白均沿细胞膜分布,界限清晰,勾勒出正常细胞的形态。吸收促进剂作用后,ZO-1、claudin-1、occludin和E-cadherin蛋白表达下降,部分蛋白散在分布于细胞质中,荧光强度减弱,提示紧密连接和粘附连接结构遭到不同程度的破坏。本试验证明葡萄糖(750mmol/L)和薄荷醇(1%)在2h内不影响Caco-2细胞活性,对细胞连接蛋白影响较小,同时极显著地促进大分子标记物FD2000S的吸收,具有良好的应用前景。试验二吸收促进剂对胶原酶在吸收效果的影响胶原酶可直接溶解纤维蛋白和间接激活纤溶酶原、改善微循环,是目前较为理想的临床溶栓药物。本研究在试验一的基础上,结合Caco-2细胞单层模型(体外)和小鼠灌胃(体内)试验,观察吸收促进剂对异硫氰酸荧光素(fluorescein isothiocyanate, FITC)标记的胶原酶在肠上皮的促吸收效果。Caco-2细胞转运试验结果显示：与对照组相比,六种吸收促进剂均可显著增加胶原酶的转运效率(P<0.05),但促吸收效果依吸收促进剂的不同而有所差别。在2h时,促吸收效果强弱依次为葡萄糖(12.87±1.0%)> EDTA (12.71±0.74%)>胆酸钠(11.27±1.21%)>薄荷醇(11.71±0.73%)＞SDS(9.17±1.74%)＞乙醇(8.37±0.74%)＞空白对照组(6.60±1.70%)。小鼠灌胃试验进一步证明吸收促进剂可显著促进胶原酶的转运效率(P<0.05),在2h时,促吸收强弱顺序为：葡萄糖(29.25±3.43%)>EDTA (26.25±2.60%)>胆酸钠(22.50±2.60%)>薄荷醇(17.24±1.33%)>SDS(14.25±1.50%)>乙醇(11.25±1.30%)>空白对照组(10.5±1.98%)。同时苏木精-伊红染色(hematoxylin-eosin staining, HE)结果显示肠黏膜形态正常,绒毛完整,无炎症。本试验证明吸收促进剂不仅能增加胶原酶在肠上皮的转运量,改善胶原酶口服给药生物利用度低的难题；同时并不损伤肠黏膜,安全性较好。试验三乳酸杆菌对肠上皮细胞连接的影响细胞连接能有效的阻止肠腔内细菌、毒素及炎症介质等物质的细胞旁路转运,维持肠黏膜屏障功能的完整。一些病原微生物可分泌毒素特异性地作用于细胞连接结构蛋白以及细胞骨架蛋白,破坏肠黏膜屏障。乳酸杆菌可以改善病原菌诱导的细胞连接结构紊乱的现象,但具体的作用机制尚不清楚。本研究结合Caco-2细胞单层模型(体外)和大鼠(体内)试验,观察产肠毒素大肠杆菌K88、沙门氏菌SARB21和SL1344对细胞连接蛋白claudin-1、occludin、ZO-1和E-cadherin的影响,同时探究乳酸杆菌对于病原菌诱导细胞连接蛋白的破坏是否具有保护作用。试验结果表明大肠杆菌K88、沙门氏菌SL1344和SARB21感染后,occludin、claudin-1、ZO-1和E-cadherin蛋白分布较正常组分散,强度减弱,细胞间隙增大,细胞轮廓不清晰。通过Western blot试验我们进一步证明,大肠杆菌K88、沙门氏菌SL1344和SARB21可使occludin、claudin-1、ZO-1和E-cadherin蛋白的表达均显著下降(P<0.05),而乳酸杆菌则可改善病原菌侵袭后细胞连接蛋白分布紊乱的现象,但对细胞连接的改善程度具有菌株特异性。本试验证明大肠杆菌K88、沙门氏菌SL1344和SARB21可影响细胞连接蛋白(occludin、claudin-1、ZO-1和E-cadherin)的表达和分布,破坏细胞连接；而乳酸杆菌可改善病原菌的这种破坏作用,对于维持细胞连接结构和肠黏膜屏障功能起着重要作用。试验四：乳酸杆菌对肠道病原菌粘附性能的影响乳酸杆菌是肠道正常优势菌群,与肠黏膜紧密结合构成肠道的生物屏障,阻止细菌、病毒和食物抗原的入侵。试验三研究结果表明,乳酸杆菌可改善病原菌诱导的细胞连接结构紊乱的现象,我们推测乳酸杆菌可能是通过抑制病原菌对肠上皮细胞的粘附,降低病原菌对细胞连接的破坏程度,维护肠黏膜屏障。本研究采用Caco-2细胞模型,通过竞争试验(competition assay).排斥试验(exclusion assay)和置换试验(displacement assay),研究乳酸杆菌(嗜淀粉乳杆菌D14、德氏乳杆菌乳亚种R4、表达绿色荧光蛋白的德氏乳杆菌乳亚种D17、德氏乳杆菌德氏亚种D11、果糖乳杆菌C2和短乳杆菌)对大肠杆菌K88、沙门氏菌SL1344和SARB21的粘附抑制作用。试验结果显示六株乳酸杆菌对大肠杆菌K88、沙门氏菌SARB21和SL1344均表现出良好的抑菌特性,病原菌粘附数量显著下降(P<0.05)。与对照组相比,在竞争试验中,德氏乳杆菌乳亚种R4和果糖乳杆菌C2极显著地降低了大肠杆菌K88的粘附数量(P<0.01)；在置换试验中,德氏乳杆菌德氏亚种D11显示了对沙门氏菌SARB21的良好拮抗作用,差异极显著(P<0.01)；在排斥试验中,德氏乳杆菌乳亚种D17和果糖乳杆菌C2则对沙门氏菌SL1344体现了良好的粘附抑制能力(P<0.01)。同时我们发现,乳酸杆菌在竞争试验和排斥试验中对病原菌的拮抗作用要优于置换试验。本试验证明乳酸杆菌可显著抑制大肠杆菌K88、沙门氏菌SARB21和SL1344对肠上皮细胞的粘附,同时提示乳酸杆菌很可能通过与病原菌竞争上皮细胞受体来抑制病原菌的粘附,为乳酸杆菌的合理运用提供理论基础。