西北地区马铃薯镰刀菌根腐病发生危害调查、病原菌鉴定及ISSR遗传多样性分析

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近年来,我国西北地区马铃薯种植面积不断增加,由于连作问题,导致马铃薯镰刀菌根腐病发生及危害也逐年加重,不仅制约着马铃薯的产量,而且影响马铃薯的品质及种薯质量,是限制马铃薯产业发展的重要因素。镰刀菌属真菌又是一类分布广、寄主多、侵染能力强的病原菌,不同地区引起该病害的病原菌种类也存在一定的差异,因此加大了该病害的防治难度。基于以上存在的问题及特点,对西北地区马铃薯镰刀菌根腐病进行病害调查、病原菌鉴定及遗传多样性分析研究。主要的结果如下:1.采用随机调查的方法对西北地区61个马铃薯主产区进行病害调查。调查显示,宁夏病害发病率最高的是固原市原州区;青海病害发病率最高的是湟源县申中乡,发病率为30%;甘肃病害发病率最高的是天祝县,发病率最低的是庆城县,发病率仅为2%;陕西调查的地区中,病害发病率最高的是横山县,发病率为60%;新疆伊宁县是五省区中病害发病率最高的地区,发病率高达80%。分析发现,调查地区均有镰刀菌根腐病的发生,不同省区、同一省区不同地方之间马铃薯镰刀菌根腐病的发病率及严重度均存在明显差异。2.通过形态学和基于ITS、EF-1α序列的分子生物学,对采集的病株/薯进行病原分离、鉴定及菌株致病性测定,共鉴定出8种镰刀菌,依次是尖孢镰刀菌、茄病镰刀菌、接骨木镰刀菌、锐顶镰刀菌、木贼镰刀菌、芬芳镰刀菌、三线镰刀菌和燕麦镰刀菌。对分离的菌株进行致病性测定,结果表明鉴定出的镰刀菌均具致病性,但不同地区引起该病害的优势致病菌不同,其中宁夏优势致病菌为茄病镰刀菌和接骨木镰刀菌,发病率为l00%和88.9%、甘肃优势致病菌是接骨木镰刀菌,发病率为88.9%、新疆优势致病菌是茄病镰刀菌,发病率88.9%、青海优势致病菌是茄病镰刀菌和燕麦镰刀菌,发病率均为88.9%、陕西的是尖孢镰刀菌,发病率77.8%。3.利用单因素变量法对ISSR-PCR的反应体系进行优化,筛选出最适的反应体系为0.6 μmol·L-1 引物浓度、56 ng·μL-1 的 DNA 及 8 μL 的 2×Easy Taq PCR SuperMix。运用优化后的体系及13条ISSR引物对供试镰刀菌进行扩增,并用NTSYSpc软件构建镰刀菌种内及种间的系统聚类树,结果表明,同种镰刀菌与地理来源存在一定的相关性,从同一地方分离的菌株亲缘关系较近;其次,ISSR聚类分析的类群划分与菌种分类之间存在一定的相关性,当遗传相似性系数为0.60,供试镰刀菌被分为四个类群,而这四个类群分别代表四种不同的镰刀菌;当遗传相似性系数递增时,供试镰刀菌被划分的类群数也呈递增趋势,当遗传相似系数为0.98时,供试镰刀菌被分成56个类群,可见在同种镰刀菌内遗传分化现象也非常明显。4.对接骨木镰刀菌最佳产孢培养基进行筛选研究,采用8种常用培养基和5种新配制培养基,对接骨木镰刀菌菌落生长和产孢量进行研究。分析发现,新配制的培养基中WLA培养基对接骨木镰刀菌的菌落生长影响最明显,而其他4个之间差异不显著,但菌落的生长均优于对照PDA培养基;从产孢量上看,WLA和OLA培养基对接骨木镰刀菌的产孢量均具有较好的促进作用,当培养至第9天,WLA培养基的产孢量高达84X 105个/mL,在新配制的培养基中WLA培养基是培养接骨木镰刀菌最佳培养基。
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